西藏林芝地區(qū)藏豬源大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因檢測

羅潤波，王　剛，云旦平措，益西旺扎，貢　嘎，索朗斯珠（西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

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西藏林芝地區(qū)藏豬源大腸桿菌耐藥表型及耐藥基因檢測

羅潤波，王剛，云旦平措，益西旺扎，貢嘎，索朗斯珠*
（西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000）

摘要：本文采集西藏林芝地區(qū)藏豬養(yǎng)殖場和散養(yǎng)藏豬腹瀉物，采用細菌學(xué)方法分離鑒定藏豬源大腸桿菌后，檢測抗菌藥物的敏感性及耐藥基因。結(jié)果顯示：林芝地區(qū)藏豬源大腸桿菌分離菌株對各種抗生素存在不同程度的耐藥性，其中對諾氟沙星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明極敏感；對氯霉素、頭孢唑林、鏈霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而對萬古霉素、青霉素、紅霉素耐藥。并檢測出P基因，其檢出率為100%。根據(jù)實驗結(jié)果，提出了科學(xué)用藥措施，為西藏林芝地區(qū)藏豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；藏豬；耐藥性基因

1　材料與方法

1.1材料

本項目于2013年1月～2013年12月期間，以滅菌棉簽蘸取采集西藏林芝地區(qū)不同藏豬養(yǎng)殖場及散養(yǎng)藏豬腹瀉物，作為細菌分離病料。

1.2藥品試劑

表1　大腸桿菌藥敏表型及耐藥基因檢測藥品

1.3儀器設(shè)備

表2　大腸桿菌藥敏表型及耐藥基因檢測儀器設(shè)備

2　方法

2.1細菌分離培養(yǎng)

將采集的腹瀉物樣品無菌接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，而后挑去單菌落依次接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，觀察結(jié)果。

2.2藥敏試驗

吸取分離后細菌普通肉湯培養(yǎng)基100 μl涂布于普通瓊脂平板上，將獸醫(yī)臨床常用的14種敏紙片，每3個藥敏紙片等距離貼于一個瓊脂平板表面，倒置平皿37℃培養(yǎng)20 h觀察、記錄結(jié)果。

2.3抑菌結(jié)果的判定

抑菌結(jié)果判定標準見表3。

表3　藥物敏感實驗判定標準

2.416SrRNA甲基化酶的基因檢測

2.4.1模板DNA的提取用質(zhì)粒提取試劑盒提取純培養(yǎng)物DNA，水煮作為模板待用。采用Primer 5設(shè)計16S rRNA甲基化酶基因1對特異性引物：rmtA。

2.4.216S rRNA甲基化酶［1］基因PCR檢測方法PCR反應(yīng)總體系為50 μl，其中包括ddH2O 36.5 μl、10× Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、Easy Taq酶0.5 μl、上下游引物各1 μl、模板2 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，擴增30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取6 μl PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

3　結(jié)果

3.1分離培養(yǎng)與鑒定

在普通瓊脂平板上經(jīng)過37℃培養(yǎng)20 h，生長良好，圓形突起、光滑、濕潤、半透明灰白色單個菌落明顯［2］。見圖1。

圖1　腹瀉物接種于普通瓊脂平板上生長的菌落

挑取普通瓊脂平板上典型的單個菌落分別接種到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20 h，在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍瓊脂平板上分別形成紅色菌落和帶金屬閃光的菌落［2］?？膳卸榇竽c桿菌。見圖2、圖3。

圖2　麥康凱培養(yǎng)基上生長的菌落

圖3　伊紅美藍培養(yǎng)基上生長的菌落

挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長的單個、紅色菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，置于空氣浴震蕩培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20 h。見圖4。

圖4　肉湯培養(yǎng)基上的生長結(jié)果

3.2藥敏試驗結(jié)果

經(jīng)過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，本次分離的大腸桿菌對諾氟沙星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明極敏感；對氯霉素、頭孢唑林、鏈霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而對萬古霉素、青霉素、紅霉素耐藥。見圖5、圖6。

圖5　藏豬源大腸桿菌對常用藥物耐藥表型結(jié)果

圖6　藥敏試驗結(jié)果

3.3生化實驗結(jié)果

對藏豬源細菌經(jīng)生化試驗鑒定，參考5種埃希菌的生化反應(yīng)［3］，可確定兩株藏豬源細菌是埃希氏菌屬大腸桿菌。見表4。

表4　藏豬源分離細菌生化試驗結(jié)果

3.4基因檢測實驗結(jié)果

檢測所用的引物中，全部檢測出P基因，檢出率100%。豬源大腸桿菌對氨基糖苷類藥物不敏感，存在耐藥基因。見圖7。

圖7　藏豬源大腸桿菌P基因電泳圖

4　討論

4.1藏豬源大腸桿菌的耐藥性

目前，濫用抗生素問題在人類使用上得到了一定的控制，但是在動物身上大量使用抗生素的情況依然非常嚴重，特別是大動物、家畜，對人類健康的威脅不容小視［4］。共生菌株耐藥性逐漸引起公眾的關(guān)注，因為這類耐藥菌株能夠不斷擴散，將耐藥基因從動物傳播給人［5，6］，關(guān)于大腸桿菌對抗生素的耐藥性問題，早已在世界范圍內(nèi)引起了重視［7，8］。

所分離得到的菌株均表現(xiàn)出了耐藥，這說明在藏區(qū)藏豬臨床上也存在大量使用抗生素、或不規(guī)范使用抗生素的現(xiàn)象。并在基因檢測中全部檢驗出P基因，所以確定其存在耐藥基因。在臨床上應(yīng)分離病原并開展藥敏試驗，以針對性地選擇藥物，從而減少或延緩細菌耐藥性的產(chǎn)生。

4.2避免耐藥性的產(chǎn)生建議

4.2.1改善飼養(yǎng)管理、優(yōu)化環(huán)境衛(wèi)生腸道中的大腸桿菌大多為正常菌群，屬于條件致病菌。所以必須加強藏豬的飼養(yǎng)管理。比如，加強通風換氣，減少藏豬圈舍內(nèi)的有害氣體等。

空氣、飲水、飼料均是大腸桿菌的主要傳播媒介，應(yīng)優(yōu)化環(huán)境衛(wèi)生，比如對糞便的及時定期消毒等。特別是豬大腸桿菌病引起的仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫?。?］等的糞便及圈舍的處理。處理方法有很多種，如：生物熱消毒或使用新潔爾滅、百毒殺等。同時，加強對藏豬圈舍外環(huán)境的消毒，比如，對進出養(yǎng)殖場的設(shè)備、車輛、人員的控制、消毒，以及定期滅鼠、滅蠅、滅蚊。對于散養(yǎng)藏豬還可以采取一定的隔離措施，比如，建立柵欄。

4.2.2減少用藥導(dǎo)致的耐藥性產(chǎn)生若藏豬已經(jīng)發(fā)生大腸桿菌病，應(yīng)該采用多種抗生素交叉、聯(lián)合使用，按照相關(guān)規(guī)定合理使用抗生素，以達到提高療效降低毒性、延緩和避免抗藥性產(chǎn)生的目的［10］。

4.2.3加強鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級基層獸醫(yī)工作人員的培訓(xùn)基層獸醫(yī)工作人員是牲畜疾病預(yù)防及生病牲畜的直接用藥指導(dǎo)。因此加強基層獸醫(yī)工作人員對相關(guān)知識的學(xué)習，普及相關(guān)醫(yī)療知識，合理使用抗菌藥。以及用藥時嚴格掌握適應(yīng)癥、適當?shù)膭┝亢童煶?，嚴格按照相關(guān)藥品使用說明書使用藥物，是減少大腸桿菌耐藥性產(chǎn)生的一個重要途徑。

4.2.4加強藥政管理相關(guān)行政管理部門必須根據(jù)相應(yīng)法律法規(guī)加強抗生素生產(chǎn)、銷售、廣告、使用的管理，控制新抗菌藥的標準，加強抗菌藥物的質(zhì)量監(jiān)督，大力整頓獸藥市場。大腸桿菌耐藥性是一個復(fù)雜的、持續(xù)進化的過程，必須長期與此做斗爭。

參考文獻：

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［10］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學(xué)（第3版）［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

（編輯：高真貞）

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：B

文章編號：1006- 799X（2016）05- 0073- 03

基金項目：由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性試驗項目，西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)科建設(shè)資助。

作者簡介：羅潤波（1991-），男，四川宜賓人，在讀碩士，主要從事高原動物傳染病相關(guān)工作。

通訊作者：索朗斯珠*