濾紙SERS基底的制備及其在精漿分析中的應用

曹剛,黃祖芳*,孫艷,杜生榮,林金勇,林居強,馮尚源,雷晉萍,林宏心,陳榮

(1.醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室,福州　350007；2.福建省婦幼保健院,福州　350001)

濾紙SERS基底的制備及其在精漿分析中的應用

曹剛1,黃祖芳1*,孫艷2,杜生榮2,林金勇1,林居強1,馮尚源1,雷晉萍1,林宏心1,陳榮1

(1.醫(yī)學光電科學與技術教育部重點實驗室,福州350007；2.福建省婦幼保健院,福州350001)

摘要:本文介紹浸泡法制備基于濾紙的SERS基底,并分析濾紙SERS基底表面銀納米粒子(AgNP)的分布與浸泡時間的關系。以精漿為檢測對象,相比于514 nm波長激發(fā)，785 nm激發(fā)可獲得更好的光譜數(shù)據(jù)，同時還比較了該波長激發(fā)下精漿的常規(guī)拉曼光譜與SERS光譜。更為重要的是,通過采用精漿中654 cm-1譜峰強度評估不同浸泡時間下(6 h,12 h,24 h)濾紙SERS基底的增強性能和測量結果的重復性。實驗結果表明,12 h浸泡獲得的濾紙SERS基底表面具有均勻的AgNP分布,在785 nm波長激發(fā)下,紙基SERS基底可提供增強效果及光譜重復性俱佳的精漿SERS光譜。

關鍵詞:表面增強拉曼散射；濾紙；銀納米顆粒；精漿

1引言

表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)現(xiàn)象于1974年由英國科學家Fleischmann等人[1]在吡啶的電化學實驗中發(fā)現(xiàn),由于其不僅克服了常規(guī)拉曼光譜存在的信號弱、易受干擾等缺點；同時還兼具高檢測靈敏度等優(yōu)點,因而引起人們的廣泛關注。近幾十年來,SERS光譜技術已發(fā)展成為生物醫(yī)學研究領域強有力的工具之一[2-4]。增強基底既是檢測物的承載基底,同時又影響著檢測信號的增強,其研究進展很大程度上決定了SERS光譜技術的發(fā)展。獲得穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的SERS光譜信號是SERS研究領域的重要目標和現(xiàn)實挑戰(zhàn)。目前,金屬溶膠由于其增強效果好、穩(wěn)定性高、容易制備等優(yōu)點已經成為實驗室及相關檢測常用的SERS增強基底[5-7],然而金屬膠體會隨著放置時間增加產生無序聚集,容易影響光譜的重復性,更不適合定量測量；采用電子束光刻[8]、熱沉降[9]等方法制備的SERS基底,雖可獲得高重復性的光譜數(shù)據(jù),但基底造價通常比較昂貴,并且固體基底堅硬易碎的缺點會降低樣品的收集效率,因此有必要發(fā)展廉價、易用同時兼具高靈敏性的SERS基底。

近幾年來,基于濾紙制備的SERS基底研究廣獲關注。濾紙質地柔軟多孔,便宜易得,且具有強親水的特性,因而是適合應用于生物醫(yī)學領域檢測研究的一種多功能載體。Yu等人[10]利用打印機在纖維素紙上打印AgNP,從而獲得快速、簡單制備的SERS基底；此外,Qu[11]等人采用絲網印刷(screen painting)的方式快速制備出重復性較好的一次性SERS基底；相比之下,利用浸泡法將金或銀膠體粒子組裝在濾紙上,從而制備出性能良好的SERS基底也有報道[12-14]。浸泡法可獲得更好的增強效果[12-13],然而浸泡法制備所需時間較長(1～2天),且目前這些研究通常主要關注于增強性能的評估,鮮見針對人體體液的檢測研究報道。

基于拉曼技術的精液檢測分析以及精液質量評估[15]，法醫(yī)學上犯罪現(xiàn)場體液樣品的區(qū)分鑒別[16]已獲得初步的研究結果,體現(xiàn)了拉曼檢測方法的優(yōu)點,使用濾紙SERS基底進行精液SERS光譜檢測未見報道。濾紙在結構和材料上具有獨特的優(yōu)勢使得濾紙SERS基底兼具濾紙的高樣品收集率和SERS基底的高檢測靈敏度的優(yōu)點,有望為體液的檢測分析提供簡單、高效的新方法。

因此,本文采用將濾紙浸泡于濃縮的銀膠溶液中進而制備出濾紙SERS基底,并對基底表面AgNP的分布狀況隨時間變化的關系做了詳細的研究。另外還通過精漿樣品的SERS光譜檢測,比較了兩種激發(fā)波長(514 nm和785 nm)在這種基底上的測試效果,初步探討了濾紙SERS基底相關檢測參數(shù)的優(yōu)化，及用于精漿體液檢測的前期可行性研究。

2實驗部分

2.1試劑

硝酸銀(AgNO3)購自上海試劑一廠,鹽酸羥胺(HONH3Cl)購自國藥集團化學試劑有限公司,氫氧化鈉(NaOH)購自天津市永大化學試劑有限公司。實驗中所用試劑均為分析純。配制溶液和實驗中均使用超純水(Milli-Q,電阻率18.2 MΩ·cm)。

2.2銀膠和樣品的準備

銀膠的制備參照Leopold和Lendl[17]文獻的方法,即采用鹽酸羥胺還原硝酸銀的方法制備。制備好的膠體在離心機以10000 r/min速度離心10 min,使銀膠分層,移液槍吸棄95%的上層清液,獲得20倍濃縮的銀溶膠,室溫下避光保存?zhèn)溆?。透射電鏡統(tǒng)計結果顯示,該方法制備的AgNP粒徑為34±5 nm。

人體精液樣品由福建省立醫(yī)院檢驗科提供,待精液液化后,精液樣品以3000 g離心力離心10 min,吸取上層精漿樣品裝入容量為1.5 mL的離心管內,置于-80℃冰箱冷藏備用。

2.3紙基SERS基底的制備

實驗中所用濾紙為英國GE醫(yī)療有限公司的Whatman 3# 濾紙。首先將濾紙剪成直徑2 cm的圓紙片,再將圓紙片分別放入裝有1.5 mL濃縮銀溶膠的培養(yǎng)皿中浸泡不同時間(6 h、12 h、24 h),隨后用干凈鑷子把浸泡后的濾紙夾到吸水紙上,快速吸走多余的水分和濾紙表面不固定的AgNP,將獲得的SERS基底在室溫下晾干20 min備用。

2.4實驗測試

為了詳細表征和評估AgNP在濾紙基底表面的分布狀況,我們使用JEOL JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡(filed emission scanning electron microscopy,FE-SEM)分別測得不同處理條件下的濾紙SERS基底10000倍放大的電鏡圖。

SERS光譜測試時,吸取10μL精漿樣品滴加在SERS基底上并于室溫下干燥10 min。測試所用儀器為裝配有785 nm和514 nm兩種波長的激光器的英國Renishaw公司Invia型共聚焦顯微拉曼光譜系統(tǒng),光譜的測量范圍是600～1800 cm-1,20倍物鏡,積分時間為10 s,曝光1次。儀器自帶的WiRE 3.4軟件測得的原始光譜數(shù)據(jù)先使用Zhao[18]等人提出的方法進行基線校正,然后在600～1800 cm-1的光譜范圍內進行歸一化處理。

3結果與討論

實驗中選用濾紙制備SERS基底一方面是由于濾紙的主要成分是纖維素,與其他種類的紙相比,濾紙只有很弱的背景信號[10],更重要的是,濾紙質地柔軟多孔并且具有很強的親水性,這種結構對金屬納米粒子的吸附以及對含水樣品的快速吸收和濃縮具有非常重要的作用。濾紙在浸泡于濃縮的銀溶膠前為白色,隨著浸泡時間的延長,濾紙顏色逐漸變?yōu)樯罨疑?這意味著有更多的AgNP吸附在濾紙上,在圖1(A)的掃描電鏡圖中可以看出,濾紙纖維呈現(xiàn)出一種互相纏繞的網狀結構,正是這種結構為金屬納米粒子的擴散和固定提供了很大的表面積和毛細作用力支持,而且這種形態(tài)有利于AgNP形成層內和層間的等離子體耦合,而后者對SERS信號的增強起到了極大地作用[13]。在圖1(B～D)中可以看到,隨著浸泡時間的延長,AgNP在濾紙上分布越來越密集和均勻,這種結構往往有利于得到重復性良好的SERS光譜。

Fig.1　FE-SEM images of filter paper after dipping into concentrated silver colloids for(A)0 h(B)6 h(C)12 h(D)24 h

鑒于濾紙基底具備的良好結構特性,我們以體液中常見的精漿為檢測對象評估這種基底的增強效果。雖然之前的研究表明常規(guī)拉曼光譜可用于精液、精漿的質量分析和法醫(yī)學上犯罪現(xiàn)場體液樣品的識別[15-16],然而精液中的大蛋白分子容易對拉曼信號產生干擾,因而常規(guī)拉曼的原始光譜信號較弱,信噪比較低,SERS技術可以克服常規(guī)拉曼測試的不足,提供更高的檢測靈敏度。圖2所示為785 nm的激發(fā)光在同一測試條件下原始精漿樣品的常規(guī)拉曼光譜(A)與濾紙基底上測量獲得的SERS光譜(B)的比較,圖3比較了經過基線校正和歸一化處理后的兩種拉曼光譜。可以看出,精漿樣品在SERS基底上的拉曼信號獲得顯著的增強,而精漿的常規(guī)拉曼信號較弱,譜峰較少,熒光背景強。而在濾紙SERS基底上進行SERS檢測時,類似于血漿與AgNP的相互作用[7]，精漿中的生化成分與AgNP相互作用,使得其拉曼信號獲得了極大地增強。在圖3中的SERS光譜可以觀察到數(shù)條主要的譜峰,包括654,724,956,1131,1212,1327,1455,1572,1649 cm-1等,根據(jù)相關文獻的結果[3,15,19],表1列出了這些主要峰位對應的的譜峰歸屬,可見,光譜輪廓及譜峰位置與之前的研究結果[3]類似,而譜峰強度的差異主要是由于樣品中不同物質成分濃度變化造成的。值得注意的是,滴加在濾紙基底上的精漿會由于濾紙的吸水作用而很快變干,這種擴散作用使得樣品得到快速濃縮并且使樣品分子可以與AgNP充分接觸,從而獲得更好的測試結果；從這方面考慮,濾紙SERS基底進行體液SERS測試比傳統(tǒng)固體SERS基底更高效。

Fig.2　Raw Raman spectra of seminal plasma(A)Normal;(B)SERS

Fig.3(A)Normal Raman spectrum of seminal plasma;(B)SERS spectrum of seminal plasma based on paper SERS substrate

Tab.1　SERS peak positions and their tentative peak assignments

為了比較濾紙基底在不同激發(fā)波長下的測試效果,實驗中分別使用波長為514 nm和785 nm的激發(fā)光進行精漿樣品的SERS光譜檢測。圖4所示為濾紙SERS基底分別在514 nm和785 nm激發(fā)下的背景信號；由圖可見,基底在600～1800 cm-1的區(qū)域內無拉曼干擾信號,只為熒光背景,這表明濾紙SERS基底在生物信息豐富的“指紋”區(qū)域(600～1800 cm-1)對樣品測試幾乎不存在影響。圖5為在兩種激發(fā)波長下獲得的精漿樣品原始SERS光譜圖,比較A(514 nm激發(fā))和B(785 nm激發(fā))兩條譜線可以看出,主要譜峰基本一致,但是514 nm激發(fā)光下的精漿SERS光譜顯示出很強的熒光背景干擾,這表明波長514 nm的激發(fā)光在光譜測量過程中膠體并沒有充分地淬滅熒光背景信號；相比之下,785 nm波長的激發(fā)光可獲得背景干擾小,譜峰更為豐富的SERS光譜數(shù)據(jù),因而波長為785 nm的激發(fā)光更適合進行精漿SERS光譜的測量。

掃描電鏡的觀察雖可提供濾紙于不同浸泡時間下AgNP在濾紙表面的客觀分布情況,然而為了全面和有效的評估精漿樣品在不同時間浸泡處理后的濾紙上的SERS光譜表現(xiàn),實驗中我們選取精漿SERS光譜中最強譜峰654 cm-1的強度來表征和比較浸泡不同時間的SERS基底的增強效果。具體實驗操作如下:激光功率為2.2 mW,每個測試樣品的中心區(qū)域選取三個不同位置點分別測量獲得三條光譜。將獲得的光譜數(shù)據(jù)統(tǒng)一扣除熒光背景后,計算獲得654 cm-1峰位光譜強度的平均值和標準差。如圖6所示,654 cm-1譜峰強度值隨浸泡時間的增加呈明顯的遞增趨勢,在浸泡24 h時強度達到最大,這與掃描電鏡下AgNP顆粒在24 h處具有最大的密度分布相符,同時從標準差值可以看出654 cm-1譜峰強度的相對誤差逐漸減小,這主要是由于浸泡時間的增加使濾紙上的AgNP密度增加,同時總體上分布更為均勻。值得一提的是,我們發(fā)現(xiàn)浸泡時間為24 h比12 h的標準差稍大一些,可能是隨著浸泡時間的增加,局部區(qū)域AgNP粒子密度分布增加的同時,形成一定厚度的聚集。因而雖然“熱點”數(shù)量增加,但是局部分布不均勻,進而導致信號強度在不同位置點的變化的增大。本文所采用的方法獲得了與Hasi等人[14]報道的類似結果,SERS基底表面具有相似均勻度的銀納米粒子分布,據(jù)估算浸泡12 h后,濾紙SERS基底的增強因子可以達到104～105數(shù)量級。更為重要的是,通過測量滴加在12 h浸泡的濾紙SERS基底上的精漿SERS光譜,以精漿SERS譜峰中最強譜峰654 cm-1的強度進行統(tǒng)計分析,計算獲得的相對誤差僅為8%,因而浸泡12 h處理的濾紙SERS基底足以確保獲得重復性較高的精漿SERS光譜。

Fig.4Background signal of filter paper-based SERS substrates under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

Fig.5Raw SERS spectra obtained from seminal plasma sample under different excitation wavelengths(A:514 nm,B:785 nm)

值得注意的是,在進行SERS光譜測試時,體液樣品在濾紙基底上大范圍的擴散有可能會影響光譜測試時信號的收集效率,另外,采用浸泡法制備SERS基底的時間相對較長,制備出的基底會由于AgNP被氧化而降低SERS活性[20]。因此,尋找一種既能縮短基底制備的時間又能確保高增強效率的濾紙SERS基底的制備方法,以及控制樣品在基底上的擴散范圍將是接下來主要開展的工作。

Fig.6Comparison of Raman peak intensity at 654 cm-1using 785 nm excitation laser

4結論

本文初步研究了浸泡法制備基于濾紙的SERS基底其表面AgNP的分布狀況與浸泡時間的關系,從電鏡圖中可以看出,隨著浸泡時間的增加,AgNP的密度也隨之增加。浸泡法提供了一種便捷的方式來制備出簡單有效并具有較好SERS活性的基底,通過對比785 nm和514 nm兩種不同激發(fā)光激發(fā)的精漿SERS光譜發(fā)現(xiàn)，785 nm激發(fā)可獲得更好的精漿SERS光譜，與傳統(tǒng)拉曼光譜相比,這種紙基SERS基底具有很好的增強效果,并且使用濾紙SERS基底可以獲得重復性較好的SERS光譜。通過對濾紙基底上精漿SERS光譜的檢測,并進一步優(yōu)化濾紙基底的性能,進而有望將濾紙SERS基底拓展到其它體液如血液、尿液等的臨床檢測分析?？梢灶A見這種基于濾紙制備的SERS基底有望在將來應用于犯罪現(xiàn)場體液的原位檢測以及臨床上基于體液的疾病快速檢測。

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Preparation of Filter Paper-Based Surface-Enhanced Raman Scattering(SERS)Substrate and Its Application for Seminal Plasma Analysis

CAO Gang1,HUANG Zu-fang1*,SUN Yan2,DU Sheng-rong2,LIN Jin-yong1,LIN Ju-qiang1,FENG Shang-yuan1,LEI Jin-ping1,LIN Hong-xin1,CHEN Rong1

(1.KeyLaboratoryofOptoElectronicScienceandTechnologyforMedicine,MinistryofEducation,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China;2.FujianMaternalandChildHealthHospital,Fuzhou350001,China)

Abstract:This article introduced a filter paper-based SERS substrate through soaking method,and investigated the relationship between the distributions of silver nanoparticles(AgNPs)on the filter paper with soaking time in detail.SERS spectra of seminal plasma under different excitation wavelengths(514 nm and 785 nm)were compared,and the latter was confirmed to demonstrate better SERS signals.SERS and normal Raman spectra of seminal plasma using 785 nm excitation laser was compared as well.More importantly,the intensity of the strongest peak(654 cm-1)from SERS spectra of seminal plasma was used to evaluated the enhancement effects and signal reproducibility with filter paper SERS substrates under different soaking time(6 h,12 h,24 h).Our results indicated that the AgNPs on the paper substrate soaked with concentrated AgNP colloid presented a relatively uniform distribution at the soaking time of 12 h and the substrate demonstrated high Raman signal enhancement and good signal reproducibility as well.

Key words:surface-enhanced Raman scattering;filter paper;silver nanoparticles;seminal plasma

文章編號:1004-5929(2016)02-0106-06

收稿日期:2015-06-15; 修改稿日期:2015-09-12

基金項目:國家自然科學基金(61308113)；福建省自然科學基金(2013J01225，2014J01399)

作者簡介:曹剛(1990-),男,碩士,主要從事表面增強拉曼散射基底的制備及性能研究。E-mail:caogang0648@163.com 通訊作者:黃祖芳,E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn

中圖分類號:O433.4

文獻標志碼:A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201602002