耐苯巴比妥鈉及苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠癲癇模型的制作*

唐太峰, 伍國鋒

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽　550081； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽　550004)

耐苯巴比妥鈉及苯妥英鈉杏仁核點燃大鼠癲癇模型的制作*

唐太峰1, 伍國鋒2

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽550081； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 建立耐苯巴比妥鈉(PB)及苯妥英鈉(PHT)的杏仁核點燃癲癇模型大鼠的方法。方法： 60只雄性健康SD大鼠制作杏仁核點燃癲癇模型，采用PHT、PB對癲癇大鼠進(jìn)行耐藥篩選，用放電閾值(ADT)來判斷癲癇大鼠對PHT和PB的敏感性，以應(yīng)用PHT或PB前的ADT值為對照(對照值A(chǔ)DT)，用藥后ADT波動范圍在20%對照值A(chǔ)DT以內(nèi)為耐藥癲癇模型判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果： 60只大鼠，死亡13只，47只大鼠完成杏仁核點燃實驗，點燃癲癇模型大鼠24只，發(fā)作強(qiáng)度4～5級，癲癇點燃率51%；PB及PHT篩選出7只耐藥的癲癇大鼠，耐藥率29.17%；耐藥大鼠用藥后仍可誘發(fā)癲癇發(fā)作，用藥后ADT波動在20%對照值A(chǔ)DT之內(nèi)。結(jié)論： 利用杏仁核慢點燃癲癇模型大鼠建立的耐藥癲癇模型可建立耐藥癲癇模型。

[關(guān)鍵詞]癲癇; 大鼠，SD; 動物模型； 杏仁核點燃; 耐藥; 苯妥英鈉; 苯巴比妥鈉

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)的常見病, 發(fā)病率占總?cè)丝诘?%～2%，目前仍以藥物治療為主。盡管治療癲癇的新藥不斷開發(fā)應(yīng)用，但仍有部分患者對藥物的反應(yīng)效果不佳，出現(xiàn)抗癲癇藥物(AEDs)耐藥的病例，且機(jī)制不明。對癲癇耐藥的研究，主要依賴于動物模型，癲癇模型制作主要有化學(xué)點燃和電點燃兩種方法，前者以藥物誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，但易于被AEDs控制，故不適合建立耐藥癲癇模型；而后者與人類癲癇癥狀學(xué)、行為缺陷、對AEDs的反應(yīng)等方面均很相似，較化學(xué)點燃模型更為理想。本研究以電點燃模型為基礎(chǔ)，并參照2015年耐藥癲癇定義[1]，探討建立理想耐藥癲癇模型的方法。

1材料和方法

1.1動物與儀器

雄性SD大鼠60只，平均體質(zhì)量(200±50)g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗動物中心。大鼠分籠單獨飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室安靜，保持溫度為(20±2)℃，相對濕度60%，光照時間12 h/d，清潔飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。 主要儀器有BL-420E生物技能實驗系統(tǒng)，江灣Ⅱ型腦立體定位儀。

1.2方法

1.2.1刺激電極制備及電極定位將2根直徑0.2 mm鎳鉻漆包線截取適當(dāng)?shù)拈L度擰為螺旋狀，連接至微型插頭，用萬用表檢測線路連通且無短路，電極長度8.5 mm；4%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，固定于大鼠腦立體定位儀，暴露顱骨及前囟，剝離骨膜，創(chuàng)面止血及骨面干燥，在右側(cè)杏仁基底外側(cè)核的顱骨表面投射點鉆孔，按G paxinos 大鼠腦立體定位圖譜定位 (前囟后2.0 mm，矢狀縫旁開5.0 mm，深度8.5 mm)，將制備好的雙極螺旋鎳鉻電極垂直插入，以502膠水及牙托粉固定于顱骨表面。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉(100 000 U/d)預(yù)防感染，大鼠術(shù)后恢復(fù)1周開始電刺激。

1.2.2點燃癲癇模型和記錄腦電圖每日予杏仁核1次電刺激(細(xì)電流，串刺激，波寬1 ms，頻率60 Hz，持續(xù)時間1 s，強(qiáng)度0.450 mA)，同時記錄后發(fā)放(after discharge ，AD，即電刺激后高幅多棘波，確認(rèn)5個以上)；對有AD及抽搐反應(yīng)大鼠繼續(xù)每日給予刺激，同時觀察發(fā)作后的發(fā)作強(qiáng)度；對無AD及抽搐大鼠放棄刺激。癲癇發(fā)作強(qiáng)度按Racine法分級(表1)，連續(xù)3次4～5級以上發(fā)作則記為完全點燃，之后不再給予刺激；連續(xù)刺激30次以上，仍未達(dá)到4～5級發(fā)作，或雖曾達(dá)到4～5級，但以后發(fā)作等級逐漸倒退，則放棄刺激。對癲癇點燃的大鼠，于點燃24 h后測后放電閾值(after discharge threshold， ADT)，ADT是指能引起后發(fā)放的最小的電流強(qiáng)度，起始強(qiáng)度定為0.02 mA，此后按每次疊加20%刺激，每5 min記錄1次，直至測出后放電波，同時記錄腦電圖。

表1　杏仁核點燃癲癇模型癲癇發(fā)作Racine’s分級

1.2.3藥物篩選耐藥癲癇模型確定點燃ADT 24 h后，按1.2.2項下方法測定ADT對照值，按苯妥英鈉(PHT)75 mg/kg計算注射液體積，以等體積生理鹽水腹腔注射，注射后1 h測ADT，起始電流強(qiáng)度為點燃ADT值20%； 24 h后腹腔注射PHT (75 mg/kg)，注射后1 h測ADT(起始電流強(qiáng)度為ADT對照值的20%)；上述步驟連續(xù)3次，每次間隔1周。然后用同樣方法進(jìn)行耐25 mg/kg苯巴比妥鈉(PB)耐藥篩選。耐藥判定根據(jù)Loscher[2]的評定方法，將ADT對照值與注射PHT或PB后所測得的ADT值對比，若連續(xù)3次注射PHT或PB后ADT值在ADT對照值的20%內(nèi)，且電刺激仍可引起癲癇發(fā)作，則判定耐藥。

2結(jié)果

2.1癲癇模型大鼠點燃情況

60只大鼠，2只置入電極時死亡、3只置入電極1 d后死亡、2只置入電極后3 d后死亡，余下53只給予電刺激，刺激過程中電極脫落6只，最終47只完成點燃過程；成功點燃24只，成功率51%，平均發(fā)作天數(shù)15 d；模型大鼠癲癇典型發(fā)作時，開始出現(xiàn)凝視、點頭、眨眼及頸部抽搐甚至全身痙攣，然后雙上肢逐漸上抬、直立、跌倒以及全身性強(qiáng)直痙攣發(fā)作；其中1只大鼠偶爾有自發(fā)性發(fā)作，最長持續(xù)時間約15 min。刺激過程中還發(fā)現(xiàn)，在上一次電刺激引起的AD結(jié)束、切換電流方向給予閾下刺激時，還可引出AD或癲癇發(fā)作；但上一次電刺激引起的AD結(jié)束較長時間以后，用同一方向和強(qiáng)度的電流給予刺激，則不能引出AD或癲癇發(fā)作。

2.2腦電圖

癲癇點燃大鼠癲癇未發(fā)作時的腦電圖以散在的α、θ波為主要表現(xiàn)，AD時腦電圖主要表現(xiàn)為單個棘波、類棘慢波、多棘波活動，發(fā)作時腦電圖主要表現(xiàn)為大量高波幅棘波、尖波發(fā)放，夾雜棘慢復(fù)合波(圖1)。

注：a為未發(fā)作時腦電圖，b為AD時腦電圖，c為癲癇發(fā)作時腦電圖圖1　杏仁核點燃癲癇大鼠腦電圖Fig.1　EEG in rats of each period

2.3行為學(xué)表現(xiàn)

電刺激過程中，予大于ADT的電流強(qiáng)度刺激后，癲癇點燃大鼠明顯比未刺激及ADT閾下刺激時表現(xiàn)為煩躁，不易抓獲、逃竄、嘶叫， 2只出現(xiàn)撕咬，其中1只發(fā)生跳躍攻擊；同步腦電圖記錄可見AD，隨著大鼠逐漸安靜，腦電圖轉(zhuǎn)為平穩(wěn)。

2.4藥物篩選

24只點燃大鼠，應(yīng)用PHT 3次后，7只通過篩選，ADT值不增高或增高小于20%，且予電刺激后仍可引起癲癇發(fā)作； 接著應(yīng)用PB 3次，7只大鼠全部通過篩選，確定為耐藥癲癇大鼠模型，耐藥率29.17%。

3討論

適宜模型的選擇是研究癲癇的重要前提。目前癲癇模型主要有遺傳模型、化學(xué)點燃模型和電點燃模型3類，其中遺傳模型因制作復(fù)雜且費用昂貴，難以實施，故目前應(yīng)用最多的為化學(xué)點燃模型和電點燃模型，對于普通癲癇的研究，2者均能很好的完成，但對于以何種模型為基礎(chǔ)建立耐藥癲癇模型更為理想，目前研究尚少，這也是本實驗要探討解決的問題?；瘜W(xué)點燃模型種類繁多，常用致癇劑有青霉素、海人酸、匹魯卡品、馬錢子堿、戊四氮、美解眠、荷包牡丹堿、印防己毒素等，目前應(yīng)用最多的耐藥性癲癇動物模型是匹魯卡品和海人酸模型。化學(xué)類模型制作簡單方便，且點燃成功率高，可達(dá)73%～96%[2-4]。但若作為篩選耐藥癲癇的模型，具有發(fā)作易于被抗癲癇藥物控制；隨著時間的推移，癲癇發(fā)作行為表現(xiàn)會逐漸倒退[5],不利于長期研究；缺乏可量化的評判指標(biāo)等缺陷。此外，目前許多耐藥癲癇模型只選用一種AEDs進(jìn)行耐藥篩選，而根據(jù)耐藥癲癇定義的核心[1]，至少對兩種或兩種以上AEDs耐藥才可稱為耐藥癲癇，故僅用一種AEDs篩選出的耐藥模型有所缺陷。

本研究認(rèn)為理想的耐藥癲癇模型應(yīng)具有以下標(biāo)準(zhǔn):(1)兩種或兩種以上AEDs不能控制其癲癇發(fā)作；(2)發(fā)作類型及對AEDs的反應(yīng)與人類相似;(3)模型發(fā)作時有腦部異常放電，可從電生理角度評價藥物療效；(4)模型穩(wěn)定且能夠長期存活，有利于進(jìn)行長期研究。而結(jié)果表明，電點燃模型篩選出的耐藥癲癇模型可很好的符合上述標(biāo)準(zhǔn)。電點燃模型是近來研究的熱點，腦內(nèi)許多部位給予適當(dāng)電刺激均可引起點燃現(xiàn)象，最經(jīng)典和常用的是海馬和杏仁核，尤以杏仁核敏感性最高[6]。根據(jù)刺激方式的不同，電點燃可分為快點燃和慢點燃兩種?？禳c燃，成功率相仿，快點燃時間短，1 d～數(shù)d，而本研究所用的慢點燃平均點燃天數(shù)15 d。雖然快點燃模型制作更為方便快捷，但是對于研究耐藥癲癇來說，仍有其缺陷：(1)發(fā)作等級會隨時間推移而倒退[5]；(2)病生理改變與慢性癲癇模型有所區(qū)別，這提示慢點燃模型較快點燃模型可能更為符合人類的病理生理學(xué)改變。并且，慢電點燃模型，一經(jīng)點燃，穩(wěn)定性好、持續(xù)時間長，短期內(nèi)不會出現(xiàn)明顯的發(fā)作等級倒退[7]。相對于化學(xué)點燃模型，電點燃模型除了觀察發(fā)作行為學(xué)的改變外，還可根據(jù)腦電圖、ADT這樣可量化的指標(biāo)來觀察發(fā)作時的電生理變化，并且可據(jù)此進(jìn)行更為可靠的藥物篩選，方便研究。本研究中，采用兩種不同作用機(jī)制的AEDs進(jìn)行藥物篩選，更加符合臨床情況，未出現(xiàn)化學(xué)點燃模型中發(fā)作易被PB控制的情況；通過觀察ADT這一敏感且可量化的指標(biāo)，能更加直觀、客觀地進(jìn)行耐藥篩選。本實驗?zāi)退幝?9.17%，與人類患者中的30%左右的耐藥率相當(dāng)[8]，符合臨床特點。本方法的缺陷主要在于，相對于化學(xué)點燃模型，此方法制作過程較為復(fù)雜，且50%左右的點燃率相對較低。

綜上所述，本研究通過慢電點燃建立的耐藥癲癇模型，相較于其他點燃方法，更為符合耐藥癲癇模型所應(yīng)具有的特點，可更好地進(jìn)行耐藥癲癇的相關(guān)研究。

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(2016-03-26收稿，2016-05-12修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

Construction of Amygdala Kindling Epilepsy Rat Model Resistant to Phenobarbital and Phenytoin Sodium

TANG Taifeng1, WU Guofeng2

(1.DepartmentofNeurology,theSecondPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550081,Guizhou,China; 2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the way for construction of the amygdala kindling epilepsy rat model resistant to phenobarbital (PB) and phenytoin sodium(PHT). Methods: 60 healthy male SD rats were selected to make the amygdala kindling epilepsy model. Amygdala kindling rats were screened by PHT and PB for their drug resistance. After discharge threshold (ADT) was used to estimate their sensitivity to PHT and PB. The criterion of drug resistance epilepsy model was based on the variations of ADT: ADT fluctuation range under 20% of ADT control value. Results: Among the 60 rats, 13 died and 47 rats completed the amygdala kindling experiment. 24 rats were successfully established into amygdala kindling epilepsy rat model, attack intensity 4～5 level and epilepsy kindling rate was 51%. 7 rats with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) were picked, and resistant rate 29.17%. Drug resistant rats could still be induced to seizure of epilepsy, and ADT fluctuation range was under 20% of ADT control value. Conclusion: The amygdala kindling epilepsy rat model with tolerance to phenobarbital sodium (PB) and phenytoin sodium(PHT) can be successfully established.

[Key words]epilepsy; rat，Sprague-Dawley; animal model; amygdala kindling; drug resistance; phenytoin sodium; phenobarbital

[中圖分類號]R749.16

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0671-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.012

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1727.052.html