HnRNPA2/B1shRNA慢病毒載體感染Hela細(xì)胞的穩(wěn)定株篩選*

劉　瑤， 石　祥， 方　文*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床生化教研室， 貴州 貴陽　550004)

·專題研究·

HnRNPA2/B1shRNA慢病毒載體感染Hela細(xì)胞的穩(wěn)定株篩選*

劉瑤**， 石祥， 方文***

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床生化教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 篩選不均一核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2/B1)的短發(fā)夾RNA (shRNA)慢病毒載體感染宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株。方法: 利用hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，采用嘌呤霉素抗性方法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞系；將Hela細(xì)胞分為空白組(Hela)、陰性組(NC-shRNA)、干擾組1(shRNA1)、干擾組2(shRNA2)、干擾組3(shRNA3)和干擾組4(shRNA4)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞hnRNPA2/B1 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)hnRNPA2/B1蛋白表達(dá)水平，篩選干擾沉默效率最高的細(xì)胞作為穩(wěn)定沉默hnRNPA2/B1基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。結(jié)果: 經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宮頸癌Hela細(xì)胞株，干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2/B1基因和蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中干擾組4沉默效率最高。結(jié)論: 成功構(gòu)建hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體感染的Hela穩(wěn)定細(xì)胞株。

[關(guān)鍵詞]RNA干擾； 短發(fā)夾RNA； 宮頸癌； Hela細(xì)胞； 慢病毒；不均一核糖核蛋白基因

在全球女性惡性腫瘤中，宮頸癌的發(fā)病率僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅著女性的健康[1]?；熢趷盒阅[瘤治療中占據(jù)著不可替代的地位，但其對(duì)大多數(shù)惡性腫瘤的療效不佳。本課題組前期用洛鉑作用宮頸癌細(xì)胞，用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteinA2/B1, hnRNPA2/B1)表達(dá)下調(diào)[2]。HnRNPA2/B1 是一組參與基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的前體mRNA結(jié)合蛋白，它的異常表達(dá)可使基因表達(dá)過程失去正常調(diào)控，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生癌變[3]。有實(shí)驗(yàn)表明干擾hnRNPA2/B1會(huì)增加抗癌藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞的敏感性[4]。本課題組前期成功構(gòu)建了hnRNPA2/B1短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)的重組慢病毒質(zhì)粒，本研究把前期構(gòu)建好的重組慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，通過RT-PCR和Western blot篩選出沉默效率最高的穩(wěn)轉(zhuǎn)Hela細(xì)胞株，為深入研究hnRNPA2/B1 在宮頸癌發(fā)生及治療奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

hnRNPA2/B1-shRNA(1-4)慢病毒液、慢病毒陰性對(duì)照(negative control-shRNA，NC-shRNA)為本實(shí)驗(yàn)組前期制備，Hela細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青公司)，SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司，美國(guó))，BSA(Sigma公司，美國(guó))，一抗(hnRNPA2/B1)(biowoeld公司，美國(guó))，二抗(鼠抗人)(Jackson ImmunoResearch公司，美國(guó))，顯影定影試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、88% DMEM，另添加1%抗生素和1% L-谷氨酰胺)37 ℃、5% CO2混合氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，換液時(shí)用PBS洗滌。

1.2.2慢病毒感染Hela細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組用胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種到3.5 cm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁達(dá)到50%的融合度時(shí)，將前期制備好的病毒原液融化后，用含5 mg/L Polybrene新鮮培養(yǎng)基按預(yù)實(shí)驗(yàn)MOI值=10×稀釋病毒原液，將含有NC-shRNA稀釋液加到陰性對(duì)照組細(xì)胞中，含有hnRNPA2/B1-shRNA慢病毒稀釋液加到處理組細(xì)胞中。在感染24 h后將含有慢病毒的培養(yǎng)液換成正常培養(yǎng)液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入終濃度為2 mg/L的Puromycin(嘌呤霉素)進(jìn)行篩選，藥物篩選約10 d后，拍熒光照片。由于慢病毒載體為pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體，含有eGFP基因和抗Puromycin基因，因此轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞在具有抗Puromycin作用的同時(shí)會(huì)發(fā)出綠色熒光。實(shí)驗(yàn)分為6組：空白組(Hela細(xì)胞)、陰性組(轉(zhuǎn)染NC-shRNA的Hela細(xì)胞)、干擾組1(轉(zhuǎn)染shRNA1的Hela細(xì)胞)、干擾組2(轉(zhuǎn)染shRNA2的Hela細(xì)胞)、干擾組3(轉(zhuǎn)染shRNA3的Hela細(xì)胞)和干擾組4(轉(zhuǎn)染shRNA4的Hela細(xì)胞)。

1.2.3hnRNPA2/B1 mRNA檢測(cè)慢病毒感染細(xì)胞成功后，將培養(yǎng)皿中10 cm2細(xì)胞加入1 mL Trizol液，分別提取每組細(xì)胞的總RNA。按下列體系和步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RNA 2 μL， 5×VILO Reaction Mix 4 μL， 10×SuperScript Enzyme Mix 2 μL， DEPC-treated water 12 μL，輕輕混勻后，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min終止反應(yīng)，所得到的cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆?。取Hela細(xì)胞的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，向體系中加入超純水5.7 μL，2×SYBR Mix7.5 μL，分別加入上游引物和下游引物各0.15 μ(表1)，模板cDNA 1.5 μL。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 10 min，PCR循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線60～95 ℃。通過RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞樣品中目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量，根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和內(nèi)參基因的域值循環(huán)數(shù)Ct值(threshold cycle number,，Ct值)，采用ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量。數(shù)據(jù)分析使用QIAGEN公司RT2 Profiler PCR Array Data Analysis 系統(tǒng)。使用轉(zhuǎn)染陰性干擾載體的樣品作為對(duì)照樣品，比較各干擾載體組樣品目的基因的表達(dá)，并計(jì)算干擾效果。ΔΔct=(待測(cè)樣品的目的基因的ct平均值—待測(cè)樣本的內(nèi)參基因的

表1　目的基因和內(nèi)參基因引物序列

ct的平均值)-(對(duì)照樣品的目的基因的ct的平均值-對(duì)照樣本的內(nèi)參基因的ct的平均值)基因的表達(dá)量F=2-ΔΔct，目標(biāo)基因的沉默效率為1-2-ΔΔct。

1.2.4hnRNPA2/B1蛋白檢測(cè) 慢病毒感染細(xì)胞后，取出狀態(tài)良好感染成功的靶細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入適量預(yù)冷的1×Lysis Buffer，取上清，用Bradford方法測(cè)蛋白濃度。每個(gè)樣品取相同總蛋白量，加入1/3體積的4× loading buffer上樣緩沖液，混勻后，沸水浴煮10 min，4 ℃存放備用。制膠，上樣，電泳可以用protein molecular weight maker作參照，轉(zhuǎn)膜，封閉，封閉結(jié)束后，用TBST溶液洗膜2次，10 min/次。用一抗(用含5% BSA的TBST溶液稀釋一抗原液)4 ℃孵育過夜，用TBST溶液洗膜3次，10 min/次，用二抗(用含5%脫脂牛奶的TBST溶液稀釋相應(yīng)的二抗)室溫孵育2 h。采用ECL試劑盒進(jìn)行顯色，取出X光片，晾干，分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1慢病毒感染Hela細(xì)胞

藥物篩選10 d后，熒光顯微鏡下，無細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)(圖1)，說明轉(zhuǎn)染hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體的Hela細(xì)胞株篩選成功。

注:A為shRNA1、B為shRNA2、C為shRNA3、D為shRNA4，E為NC-shRNA圖1　藥物篩選后的Hela細(xì)胞(100×)Fig.1　Hela cells under fluorescence microscope after drug screening

2.2慢病毒感染Hela細(xì)胞后hnRNPA2/B1 mRNA表達(dá)及抑制率

Hela細(xì)胞中的目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線及熔解曲線(圖2)，說明hnRNPA2/B1和Actin為特異性擴(kuò)增，無非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。陰性組與空白組hnRNPA2/B1基因表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2/B1基因表達(dá)量降低(P<0.05)，其中干擾組4沉默效率最高(76.58%)。見表2。

2.3慢病毒感染Hela細(xì)胞后hnRNPA2/B1 蛋白表達(dá)及抑制率

陰性組與空白組hnRNPA2/B1蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干擾組1、干擾組2，干擾組3和干擾組4與空白組比較，hnRNPA2B1蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中干擾組4的沉默效率最高(76.24%)。見圖3。

3討論

宮頸癌嚴(yán)重威脅著女性的健康。2015中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)指出，近年女性發(fā)病率持續(xù)上升的六種癌癥中就包括宮頸癌，女性死亡率持續(xù)上升的三種癌癥中也包括宮頸癌。治療宮頸癌最有效的化療藥物是鉑類藥物，但自從鉑類藥物開始應(yīng)用于臨床以來療效不佳。這就需要尋找新的治療靶點(diǎn)。

圖2　HnRNPA2/B1和Actin擴(kuò)增曲線及融解曲線Fig.2　Amplification curve and Melting curve of HnRNPA2/B1 and Actin

組別ACTINCtHNRNPA2B1Ct2-ΔΔCt抑制率(%)空白組17.21±0.0612.44±0.251.00±0.130陰性組17.14±0.0912.57±0.190.95±0.084.25干擾組117.41±0.0412.82±0.120.90±0.229.74干擾組217.17±0.0913.19±0.04(1)0.51±0.02(2)48.44干擾組317.19±0.0913.79±0.08(1)0.38±0.01(2)61.39干擾組417.37±0.0814.71±0.04(1)0.23±0.03(2)76.58

與空白組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

注：A為條帶圖，1組～4組為干擾組；B為柱狀圖，(1)與空白組比，P<0.01圖3　各組hnRNPA2/B1-shRNA的沉默效果(Western Blot) Fig.3　Western Blot verifies the silence effect of hnRNPA2/B1-shRNA

核內(nèi)不均一核糖核蛋白A2/B1是由hnRNPA2和hnRNPB1共同組成的RNA連接蛋白復(fù)合體[5]。hnRNPA2與hnRNPB1是起源于人的第7染色體的p15上的同一個(gè)單拷貝基因，經(jīng)過不同的剪接作用形成的變異體，兩者不同之處在于hnRNPB1的第2個(gè)外顯子在選擇性剪切的作用下N端額外插入了12個(gè)氨基酸序列[6]。HnRNPA2/B1在胞質(zhì)與核內(nèi)之間穿梭具有將mRNA輸出到胞質(zhì)的功能，參與mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、RNA的代謝、DNA的復(fù)制、外顯子剪切位點(diǎn)選擇、Pre-mRNA的成熟和降解，對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的有絲分裂等也起重要作用[7]。近年來研究表明，hnRNPA2/B1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。hnRNPA2/B1已經(jīng)被證實(shí)是一種原癌基因，不僅參與腫瘤形成和癌細(xì)胞的惡性增殖，同時(shí)也已成為腫瘤診斷和預(yù)后判定的指標(biāo)[8]。HnRNPA2/B1在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝、分化、遷移、侵襲、多藥耐藥和血管形成等，其中對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡作用的調(diào)控更為顯著[9-10]。細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞凋亡失調(diào)是近年來腫瘤研究熱點(diǎn)之一，陳倩竹[11]指出通過下調(diào)骨肉瘤MG-63細(xì)胞中hnRNPA2/B1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和成瘤能力均明顯減弱，同時(shí)早期凋亡增加。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞中hnRNPA2B1可與Bcl-X mRNA結(jié)合, 抑制hnRNPA2B1基因可上調(diào)Bcl-X(S)與Bcl-X(L)的比值，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。有研究指出，上調(diào)hnRNPA2/B1基因的表達(dá)水平，細(xì)胞增殖活性會(huì)隨著增強(qiáng)及促進(jìn)腫瘤形成[13]。同時(shí)，在裸鼠成瘤方面，抑制鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞 hnRNPA2/B1可抑制腫瘤的形成，試驗(yàn)證明hnRNPA2/B1基因序列可被抑制，減少hnRNPA2/B1過度表達(dá)，從而抑制腫瘤形成[14]。可能的機(jī)制是由于hnRNPA2/B1與端粒單鏈 DNA 重復(fù)序列特異性結(jié)合后，能保護(hù)后者免受核酶分解。同時(shí)，hnRNPA2/B1還能激活端粒酶，促進(jìn)端粒延伸，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖[7]，但具體機(jī)制還不是很清楚。因此，對(duì)hnRNPA2/B1基因的深入研究有助于尋找治療宮頸癌的新靶點(diǎn)。

本課題組前期成功構(gòu)建了hnRNPA2/B1慢病毒干擾載體。本研究應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞，由于pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體本身攜帶eGFP基因和抗puromycin基因，因此，觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，同時(shí)用終濃度為2 mg/L的puromycin進(jìn)行篩選，最終獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞株。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，用RT-PCR和Western blot對(duì)4組Hela細(xì)胞進(jìn)行hnRNPA2/B1表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組與空白組表達(dá)差異不顯著，而shRNA4干擾組沉默效率在mRNA水平和蛋白水平均達(dá)到70%以上，說明本研究構(gòu)建的慢病毒干擾載體hnRNPA2B1-shRNA4可以沉默hnRNPA2B1基因的表達(dá)，篩選出shRNA4組Hela細(xì)胞為穩(wěn)定沉默hnRNPA2/B1基因表達(dá)的細(xì)胞株。為進(jìn)一步探討hnRNPA2/B1基因在宮頸癌Hela細(xì)胞中的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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(2016-03-20收稿，2016-05-27修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

Screening of Stable Hela Cell Infected with hnRNPA2/B1 shRNA Lentivirus

LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen

(DepartmentofClinicalBiochemistry,GuizhouMedcialUniversity，Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To screen the stable Hela cell line infected with hnRNPA2/B1shRNA lentivirus vector. Methods: hnRNPA2/B1 shRNA lentivirus vector was used to stably transfect into HeLa cells. The Hela cell lines were screened by using the method of resistance of puromycin. Hela cell lines were divided into blank group(Hela group), negative group (NC-shRNA group), interference group1 (shRNA1group), interference group2 (shRNA2 group), interference group3 (shRNA3 group) and interference group4 (shRNA4 group). RT-PCR was adopted to detect the mRNA expression level of hnRNPA2/B1 and Western blot adopted to detect the protein expression level of hnRNPA2/B1. A group of cells with the highest silencing efficiency was selected as the Hela lines of hnRNPA2/B1 gene stable silencing. Results: Stably transfected HeLa cell line of cervical cancer was obtained by screening. Compared with blank group, mRNA level and protein level of hnRNPA2/B1 gene expression significantly decreased in shRNA2 group, shRNA3 group and shRNA4 group (P<0.01). Among them, silence efficiency was highest in shRNA4 group. Conclusion: Stable Hela cell line infected with hnRNPA2/B1shRNA lentivirus vector is successfully constructed.

[Key words]RNA interference; Short hairpin RNA; cervical carcinoma; Hela cell line; lentivirus; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81560481)

[中圖分類號(hào)]Q782

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0625-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.002

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:281123997@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1645.020.html