補(bǔ)腎益髓方及其拆方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中β-APP和MAP-2表達(dá)的影響*

安辰　王永強(qiáng)　師一民　趙暉　李明　齊放　張秋霞　陳振振　樊永平　王蕾△（.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京　00069；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京　00050）

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補(bǔ)腎益髓方及其拆方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中β-APP和MAP-2表達(dá)的影響*

安辰1王永強(qiáng)1師一民1趙暉1李明1齊放1張秋霞1陳振振1樊永平2王蕾1△
（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050）

【摘要】目的觀察補(bǔ)腎益髓（BSYS）方及其拆方補(bǔ)腎（BS）和化痰活血（HTHX）方對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠腦和脊髓中β-淀粉樣前體蛋白（β-APP）和微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）的作用。方法56只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC）、模型組（MO）、醋酸潑尼松組（PA）、梓醇組（CA）、補(bǔ)腎益髓組（BSYS）、補(bǔ)腎組（BS）和化痰活血組（HTHX），每組8只。對照藥給予PA（6 mg/kg），CA（40 mg/kg）；BSYS、BS 和HTHX組分別以3.02 g，1.44 g和1.57 g生藥/kg給藥。NC及MO組以等量蒸餾水代替。每日1次，連續(xù)灌胃40 d。小鼠發(fā)病第25日（急性期）和第40日（緩解期）取腦和脊髓，采用免疫熒光（IF）法檢測β-APP表達(dá)，免疫組化（IHC）法檢測MAP-2的表達(dá)。結(jié)果發(fā)病第25日和第40日，MO組小鼠腦β-APP表達(dá)較NC組顯著上調(diào)（P＜0.001），而MAP-2表達(dá)則較NC組明顯下調(diào)（P＜0.01或P＜0.001），與MO組比較，各治療組（PA、CA、BSYS、BS和HTHX組）均可明顯下調(diào)β-APP蛋白表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），上調(diào)MAP-2表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01）。其中發(fā)病第25日小鼠腦β-APP表達(dá)PA組效果優(yōu)于CA、BS及HTHX組（P＜0.05）。各組小鼠脊髓內(nèi)β-APP、MAP-2表達(dá)變化趨勢與腦相似。結(jié)論BSYS方及其拆方均能減輕軸突損傷及促進(jìn)其修復(fù)，尤以BSYS全方更為顯著。

【關(guān)鍵詞】補(bǔ)腎益髓方及其拆方多發(fā)性硬化實驗性自身免疫性腦脊髓炎β-APP MAP-2

多發(fā)性硬化（MS）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）脫髓鞘疾?。?］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是其經(jīng)典動物模型［2］。研究顯示MS/EAE病變早期和進(jìn)展階段均存在不同程度的軸突損傷，并且損傷的不斷積累最終導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)功能障礙［3-4］。因此，在治療MS過程中，減輕軸突損傷并促進(jìn)其修復(fù)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，MS患者以肝腎陰虛和痰瘀阻絡(luò)為其主要證候特征［5］。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院樊永平教授根據(jù)其病機(jī)特點，以補(bǔ)腎配伍化痰活血法研制的補(bǔ)腎益髓（BSYS）方治療MS，臨床實踐已證實其對MS有明確療效［6］，實驗研究也表明BSYS方對EAE小鼠有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［7］。為了深入探討B(tài)SYS方的作用機(jī)制，筆者依其治法將其拆分為補(bǔ)腎（BS）方和化痰活血（HTHX）方。前期細(xì)胞實驗顯示，BSYS和BS含藥血清可明顯促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞軸突生長，且以BSYS方作用顯著［8］。

β-淀粉樣前體蛋白（β-APP）在神經(jīng)元胞體合成，經(jīng)軸漿快速運輸至軸突遠(yuǎn)端。β-APP于軸突受損后表達(dá)上調(diào)，是反應(yīng)軸突損傷的標(biāo)志性蛋白［9］。微管相關(guān)蛋白-2（MAP-2）是神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白的主要成分之一，對神經(jīng)元的發(fā)育，軸突和樹突的發(fā)生、延長和穩(wěn)定具有重要作用［10］。本實驗采用EAE小鼠模型，通過免疫熒光（IF）及免疫組化法（IHC），觀察BSYS方及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓中β-APP和MAP-2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討B(tài)SYS方對軸突損傷及其修復(fù)的作用。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級雌性C57BL/6小鼠56只，體質(zhì)量控制在15～17 g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心［SCXK（軍）2012-0004］。

1.2藥物與試劑BSYS方（生地黃、熟地黃、浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等）、BS方（生地黃、熟地黃等）和HTHX方（浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等）均由北京亞東生物制藥有限公司制備。醋酸潑尼松片（PA）由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)，梓醇（CA）由杭州康木科技有限公司提供。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；滅活結(jié)核分枝桿菌（H37Ra，MTB，貨號231141）由美國BD公司提供；完全弗氏佐劑（CFA，貨號F5881）、百日咳毒素（PTX，貨號P7208）均由美國Sigma公司提供；β-APP（貨號ab152720）和MAP-2抗體（貨號ab32454）均由美國abcam公司提供；Alexa Fluor594標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號ZF0516）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司等。

1.3主要儀器光學(xué)顯微鏡（北京銳馳恒業(yè)儀器有限公司，CX23）；熒光顯微鏡（德國LEICA，Leica TCS SP5）。1.4分組與造模56只小鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC）、模型組（MO）、PA組、CA組、BSYS組、BS組及HTHX組7組，每組8只。方法為：小鼠背部皮下注射0.2 mL抗原（含50 μg MOG35-55、100 μL CFA、4 mg/mL MTB），分別于首次免疫當(dāng)天及免疫后第7日各注射1次［11］，免疫當(dāng)日及2 d后腹腔注射500 ng PTX。NC組用等量生理鹽水代替。

1.5給藥方法免疫當(dāng)日開始灌胃給予各組小鼠相應(yīng)藥物。對照藥劑量PA（6mg/kg），CA（40 mg/kg）；BSYS、BS和HTHX組分別以3.02 g生藥/kg，1.44 g生藥/kg和1.57 g生藥/kg給藥。NC及MO組以等量蒸餾水代替。每日1次，連續(xù)40 d。

1.6標(biāo)本采集與檢測發(fā)病第25日（急性期）和第40日（緩解期）取小鼠腦和脊髓，每組4只。常規(guī)灌流，4%多聚甲醛內(nèi)、外固定。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以2 μm厚度連續(xù)切片。

1.7觀察指標(biāo)1）IF染色。切片脫蠟水化，微波修復(fù)，室溫冷卻，羊血清封閉2 h，滴加β-APP一抗稀釋液（1∶50），4℃孵育48 h，37℃復(fù)溫1 h，避光加入熒光二抗稀釋液（1∶100），37℃孵育2 h，DAPI封片。熒光顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個不重疊視野拍照，用Leica Qwin軟件測定積分光密度（IOD）值。2）IHC染色。切片脫蠟水化，微波修復(fù)、室溫冷卻，3%H2O2室溫孵育10 min，羊血清封閉（腦1 h；脊髓2 h），滴加MAP-2一抗稀釋液（1∶200），4℃孵育24 h。37℃復(fù)溫1 h，依次滴加二抗試劑，置于37℃下孵育，DAB顯色1 min，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個不重疊視野拍照，用NIS-Elements BR 3.2軟件測定IOD值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組BSYS、BS及HTHX方對各組小鼠腦和脊髓中β-APP表達(dá)比較見表1，圖1，2。結(jié)果示，發(fā)病第25日和第40日，MO組小鼠腦β-APP表達(dá)較NC組顯著上調(diào)（P＜0.001），各治療組小鼠腦β-APP表達(dá)與MO組相比不同程度下降（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），且發(fā)病第25日PA組效果優(yōu)于CA、BS及HTHX組（P＜0.05）。各組小鼠脊髓內(nèi)β-APP表達(dá)變化趨勢與腦相似。

2.2各組BSYS、BS及HTHX方對各組小鼠腦和脊髓中MAP-2表達(dá)的影響見表2，圖3，圖4。結(jié)果示，發(fā)病第25日和第40日，MO組小鼠腦MAP-2表達(dá)較NC組明顯下調(diào)（P＜0.01或P＜0.001），各治療組小鼠腦MAP-2表達(dá)與MO組相比不同程度上升（P＜0.05 或P＜0.01）。各組小鼠脊髓內(nèi)MAP-2表達(dá)變化趨勢與腦相似。

表1　各組小鼠不同時間點腦及脊髓中β-APP的表達(dá)變化比較（IOD，±s）

表1　各組小鼠不同時間點腦及脊髓中β-APP的表達(dá)變化比較（IOD，±s）

與NC組比較，***P＜0.001；與MO組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，與PA組比較，△P＜0.05，△△P＜0.05。下同。

組別　n MO　4 PA　4 腦1004.35±52.56***960.35±37.44***588.26±62.03###704.49±57.02###脊髓641.71±35.00***628.62±36.75***402.00±40.40###423.10±28.29###第25日　第40日　第25日　第40日NC　4　463.76±47.25　486.76±44.06　334.17±30.24　348.29±35.31 CA　4　794.05±74.77#△780.21±42.32#　512.10±24.66#△498.17±38.64#BSYS　4　634.78±53.65##722.09±61.86##467.30±26.26##454.26±53.96##BS　4　786.61±74.52#△774.49±69.79#　510.34±22.60#△△476.48±47.16#HTHX　4　801.10±41.48#△806.08±57.74#537.21±27.13#△△509.14±34.71#

圖1　各組小鼠腦β-APP的表達(dá)變化（IF，×400）

圖2　各組小鼠脊髓β-APP的表達(dá)變化（IF，×400）

表2　各組小鼠不同時間點腦及脊髓中MAP-2的表達(dá)變化比較（IOD，±s）

表2　各組小鼠不同時間點腦及脊髓中MAP-2的表達(dá)變化比較（IOD，±s）

組別　n MO　4 PA　4 腦8.39±0.73**　9.19±1.02***12.52±1.41##　13.87±0.98##脊髓15.48±1.43***　16.40±1.26***21.00±1.21##　22.82±0.89##第25日　第40日　第25日　第40日NC　4 13.38±1.08　14.69±1.07　24.30±1.25　24.88±1.23 CA　4 11.56±0.89#　12.54±1.15#　19.62±1.12#　20.34±1.30#BSYS　4 12.83±1.21##　14.00±0.94##　21.01±1.24##　22.91±1.18###BS　4 11.61±1.02#　12.66±1.12#　20.18±1.00##　21.43±1.10##HTHX　4 11.48±1.08#　12.26±1.20#　19.32±1.11#　19.76±1.17#

3　討論

CNS有髓神經(jīng)纖維由軸突及包裹其外的髓鞘構(gòu)成。脫髓鞘及軸突損傷等病理變化是MS/EAE的重要特征，且后者被認(rèn)為是導(dǎo)致MS患者神經(jīng)功能障礙的重要原因［12-13］。研究顯示，MS患者外周血中增多的CD4+ T淋巴細(xì)胞入侵CNS以及腦脊液中針對髓鞘成分的IgG或IgM型抗體均可破壞髓鞘結(jié)構(gòu)。脫髓鞘后，軸突成分暴露，引發(fā)自身免疫反應(yīng)最終導(dǎo)致軸突損傷［14-17］。糖皮質(zhì)激素（如PA等）能減少炎細(xì)胞激活并抑制其侵入CNS，從而減輕軸突損傷，是治療MS的首選藥物［18］。針對MS虛實夾雜的病機(jī)特點，BSYS方中地黃等滋腎養(yǎng)陰，浙貝母、益母草、水蛭、全蝎等化痰祛瘀。CA是君藥地黃的質(zhì)控成分，因其具有保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)樹突、軸突芽生等重要作用，而廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)研究［19-20］。

β-APP在正常情況下表達(dá)較低，但軸突發(fā)生損傷后，β-APP軸突運輸被阻斷，其集聚、堆積在受損軸突近胞體側(cè)，并形成卵圓體，對軸突損傷可起到提示作用，故其可作為一種軸突損傷的快反應(yīng)蛋白［9］。研究報道，MS/EAE急性期病變組織中可見較多的β-APP沉積［4，9］。但另有學(xué)者認(rèn)為，由于EAE急性期彌漫性炎癥反應(yīng)，細(xì)胞變性水腫引起胞內(nèi)蛋白合成分泌障礙使β-APP表達(dá)下降；在EAE緩解期，炎癥反應(yīng)消退，但持續(xù)存在的彌漫性刺激，可導(dǎo)致軸突斷裂、崩解，令β-APP表達(dá)持續(xù)增高［21］。本實驗中，MO組小鼠腦和脊髓中β-APP表達(dá)明顯高于NC組，提示存在軸突彌漫性損傷。與MO組比較，BSYS方及其拆方BS和HTHX方明顯降低上述部位β-APP的表達(dá)，說明3者均具有減輕軸突損傷的作用，且以BSYS方最為明顯。

神經(jīng)元中MAP-2的表達(dá)下降會導(dǎo)致微管在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)運輸、塑性等方面的障礙［10］。目前，MS/EAE研究中有關(guān)MAP-2的報道較少。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)MAP-2表達(dá)均明顯低于正常組，提示細(xì)胞骨架發(fā)生降解。經(jīng)BSYS方干預(yù)后，相應(yīng)部位MAP-2表達(dá)增高，說明其可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的修復(fù)［7］。本實驗中MO組、BSYS組MAP-2表達(dá)情況與前期實驗一致，且結(jié)果顯示BS組及HTHX組亦可上調(diào)EAE小鼠腦和脊髓內(nèi)MAP-2表達(dá)，從而對神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)修復(fù)起到促進(jìn)作用，但效果仍以BSYS方更為顯著。

MS病位在腦髓，腎主骨生髓，腎陰不足，則骨枯髓減，故補(bǔ)腎生髓是治病之本。對于病程中出現(xiàn)的痰瘀互結(jié)之弊，常以化痰活血法治之［22］。本實驗結(jié)果表明，單獨使用BS方或HTHX方均可達(dá)到減輕軸突損傷及促進(jìn)修復(fù)的目的，若將二者相合為用，則收相輔相成之效，加強(qiáng)了方藥對軸突的保護(hù)作用，其治療效果優(yōu)于拆方。

圖3　各組小鼠腦MAP-2的表達(dá)變化（IHC，×400）

圖4　各組小鼠脊髓MAP-2的表達(dá)變化（IHC，×400）

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·研究報告·

·研究報告·

Effects of Bu Shen Yi Sui and its Disassembled Formulas on the Expression of β-APP and MAP-2 in the Brain and Spinal Cord of Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

AN Chen，WANG Yongqiang，SHI Yimin，et al.School of Traditional Chinese Medicine，Beijing Key Lab of TCM Collateral Disease Theory Research，Capital Medical University，Beijing 100069，China.

【Abstract】Objective：To observe effects of Bu Shen Yi Sui（BSYS）and its disassembled formulas，Bu Shen（BS）and Hua Tan Huo Xue（HTHX）formulas on the expression of β-amyloid precursor protein（β-APP）and microtubule-associated protein-2（MAP-2）in the brain and spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）.Methods：Female C57BL/6 mice were randomly divided into normal control（NC），model （MO），prednisone acetate（PA），catalpol（CA），BSYS，BS and HTHX groups.The mice were received daily gavage administration for 40 days.The protein expression of β-APP and MAP-2 in the brains and spinal cords of mice were measured by immunofluorescence（IF）and immunohistochemistry（IHC）respectively on Day 25 and Day 40 after immunization.Results：Compared with MO group，BSYS，BS and HTHX formulas significantly reduced the expression of β-APP in brains and spinal cords of mice（P＜0.05 or P＜0.01），meanwhile，significantly increased MAP-2（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Both BSYS and its disassembled formulas can relieve axonal injury and promote its repair，especially in the BSYS formula.

【Key words】Bu Shen Yi Sui and its disassembled formulas；multiple sclerosis；experimental autoimmune encephalomyelitis；β-APP；MAP-2

中圖分類號：R287.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0565-05

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.001

*基金項目：國家自然基金（81273742，81573898）；北京市教委重點項目（KZ201310025023）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計劃-長城學(xué)者項目（CIT&TCD20140329）

通信作者△（電子郵箱：tmwangl@ccmu.edu.com）

收稿日期（2015-11-03）