食品中致病菌的檢測方法研究進展

雷小玲　王晨陽　金夢凡　程書雯　尹爭志

【摘 要】十三五時期，食品安全問題受到了普遍關注與各級政府的重視。其中，食源性致病菌是食品衛(wèi)生問題的主要源頭，對其進行早期及時檢測，可以有效預防疾病發(fā)生和準確診斷，具有十分重要的意義。目前的檢測方法主要包括免疫學檢測技術、分子生物學檢測技術、生物傳感器檢測技術、代謝學檢測技術、噬菌體識別檢測技術等。本文總結了食源性致病菌檢測方法的研究現(xiàn)狀，雖然檢測水平得到了顯著的提升，但均存在一定程度的不足，仍需不斷改進。

【關鍵詞】食源性致病菌；分析檢測；進展

【Abstract】During the 13th Five-Year of China， food safety has been widespread concerned by people and governments. Among them， foodborne pathogens are the main source of food hygiene issues. Early and timely detection of foodborne pathogens can effectively prevent the occurrence of disease， which is of great significance. The current detection methods mainly include immunological detection technology， molecular biological detection technology， biological sensor detection technology， metabolic detection technology， phage recognition detection technology. This paper summarizes the research status of the detection methods of foodborne pathogens， although the detection level has been significantly improved， but there is a certain degree of shortage， and still need to continue for improving.

【Key words】Foodborne pathogens； Detection and analysis； Progress

0 引言

近年來，食品安全問題引起了世界各國的普遍重視。據(jù)WHO初步統(tǒng)計，全世界每年的食源性疾病中，70%是由致病微生物引發(fā)的[1]。食源性疾病和食品污染問題已成為世界范圍內舉足輕重的公共衛(wèi)生問題。在我國，每年上報的食物中毒人數(shù)逐年遞增，且大部分是由食品中致病菌引起[2]。十三五時期，史上最嚴的食品安全法提出了更高的要求和發(fā)展規(guī)劃，食品安全已經成為國家安全的一部分。其中，建立有效的食源性致病菌檢測體系，快速準確完成食品中致病菌的檢測，也成為保障食品安全和防止疾病傳染的關鍵[3-5]。下面主要對目前國內外食源性致病菌的檢測方法進行歸納和概述。

1 免疫學檢測

免疫學檢測依據(jù)免疫學理論和技術，基于抗原抗體反應，從而設計抗原、抗體、免疫細胞、細胞因子的檢測分析方法。微生物表面具有其特異的抗原，并能激發(fā)機體產生相應的特異性抗體；通過抗體結合表面抗原位點反應前后的信號變化，檢測目標物；其中，借助標記物進行間接檢測的研究，得到了快速的發(fā)展和檢測效果的改善。近年來，發(fā)展較快的免疫檢測方法有如下四類。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附分析法的關鍵點是酶標記，利用標記酶對底物的高效催化性能，將信號進行放大，從而達到靈敏檢測致病菌的目的。在檢測時，常借助抗原抗體間的特異性，通過三明治夾心結構將酶引入體系，此時載體上的酶量與待測菌的量呈現(xiàn)一定的比例。加入酶的催化底物，酶與底物反應后所形成產物的量與待測菌的量呈現(xiàn)一定的關系，因此只要檢測出產物的量就可以定性或定量檢測致病菌。由于酶有較高的催化效率，間接放大了免疫檢測信號，該類檢測方法具有較高的靈敏度。

1.2 熒光免疫檢測法

1941年，Coons等首次將熒光素用作標記構建檢測體系。經過發(fā)展，該類方法的標記物拓展到其它熒光活性分子，標記對象主要為抗原、抗體，在免疫反應結合后，通過熒光成像、熒光光度計等檢測標記物的熒光信號，間接表示目標物含量。該類方法在可視化檢測領域具有很好的應用前景。

1.3 免疫膠體金標記分析法

免疫膠體金標記技術主要包括膠體金光鏡染色法、斑點金免疫滲濾法和膠體金免疫層析法。它是一種將膠體金標記技術、層析分析技術以及免疫檢測相結合的快速檢測技術。其原理是依靠抗原與抗體的特異性結合，最終使膠體金變色，從而達到定性或定量檢測目的。在檢測時，將抗原滴至加樣孔膜上與金標抗體結合，在吸水材料的牽引下沿試條展開，到達檢測線時由于特異性結合形成兩個抗體結合一個抗原的復合物，由于金顆粒的沉淀，因此檢測線呈紅色。未結合抗原的抗體行至對照線，與上邊的抗體結合，使得對照的線呈現(xiàn)紅色，出現(xiàn)兩條紅線。若不含有目標致病菌則不發(fā)生結合，檢測線不變紅色，最終只出現(xiàn)一條紅線。

1.4 免疫磁珠技術

免疫磁珠分離技術將磁性分離與免疫反應相結合，從而構建免疫學檢測技術；首先在磁珠上包被抗體，再與特定抗原發(fā)生特異性結合，將目標菌進行識別分離，最后磁力富集。該類方法特異性強、靈敏度高、反應時間短。如果將免疫磁珠分離技術與快速檢測技術相結合，可以將致病菌檢測時間由傳統(tǒng)的幾天縮短到幾小時，因此，在食源性致病菌檢測中，免疫磁珠技術具有廣闊的發(fā)展空間。

2 分子生物學檢測技術

核酸生物分子作為生命體的基本單元，負責遺傳信息的編碼、傳輸及表達，作用非常重要。它由核苷酸組成，根據(jù)化學組成不同分為核糖核酸（簡稱RNA）和脫氧核糖核酸（簡稱DNA）。目前已有的核酸擴增技術分為兩大類：靶核酸的直接擴增與信號放大擴增。靶核酸直接擴增包括聚合酶鏈式反應、鏈替代擴增、連接酶鏈式反應和核酸依賴擴增、轉錄介導擴增和滾動環(huán)擴增；另一類是信號放大擴增：包括支鏈DNA、侵染探針和滾動環(huán)擴增等。分子生物學方法在致病菌檢測領域，得到了很好的應用[7]。

2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

1985年，Mullis等人發(fā)明了PCR技術，相對而言，PCR技術具有特異性高、靈敏度好、操作簡單、重復性好的優(yōu)點。PCR是一種DNA體外復制技術，通過復制放大，擴增目標互補DNA片段，以微量的DNA為起點，獲得大量的復制DNA。PCR的基本原理和DNA復制過程相似，其特異性依賴于靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。一般分為三個階段：加熱模板DNA發(fā)生變性；冷卻使模板DNA與引物互補序列配對結合；在適度的溫度下進行引物的延伸。重復這三個過程能獲得更多半保留復制鏈，從而能在短時間內將目的基因擴增放大幾百萬倍，PCR技術主要應用于單管PCR產物的實時熒光檢測。

2.2 連接酶鏈式反應（LCR）

1987年，Backman研究發(fā)明了LCR方法技術。1991年，Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶延伸了LCR試驗，為LCR的實用發(fā)展奠定了基礎。LCR技術依靠堿基的互補配對原理開展檢測，在DNA連接酶的作用下，通過連接與模板DNA互補的兩個相鄰寡核苷酸鏈，進行DNA片段的快速擴增，從而復制出大量靶基因。

2.3 環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）

2000年，Notomi等首次提出LAMP技術，LAMP技術依靠能對靶序列上的6個獨立區(qū)域特異性識別的4種引物，及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過循環(huán)鏈置換反應，達到靶序列的擴增。反應包括兩個階段，循環(huán)擴增始發(fā)物的形成與循環(huán)延伸。首先，由外部引物擴增出內部引物所需的模板，接著內部引物對靶基因片段進行引導合成。如此循環(huán)反應最終形成帶有類似花椰菜的莖-環(huán)結構，該法可在短時間內實現(xiàn)109—1010倍的擴增。Malcolm等首次結合多重PCR技術和LAMP方法，構建了副溶血性弧菌的定量檢測體系[9]。Lee結合LAMP和免疫層析技術，以未前處理的全血和牛奶為檢測對象，實現(xiàn)了金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7的檢測[10]。LAMP方法是一種快速簡便、省時省力、特異性好、靈敏的致病菌檢測技術。

2.4 滾動環(huán)式擴增（RCA）

RCA是一種較新的恒溫核酸擴增技術，原理類似于噬菌體復制過程，它以環(huán)形DNA為模板，通過一個與部分模板DNA互補的較短DNA引物，在酶的催化下將dNTPs轉變成包含無數(shù)個能與模板互補的單鏈DNA片段，因此，它既可以進行靶核酸基因的擴增，又可以進行型號的放大擴增。滾動環(huán)式擴增分為兩種形式：線性擴增和指數(shù)擴增。線性擴增是指引物結合到模板DNA后，在酶的作用下，產物具有無數(shù)個能與模板互補的線狀單鏈DNA片段，線性RCA僅僅適用于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、染色體的擴增。RCA可以使產物呈線性增加，因此可以用于靶核酸的定量檢測。指數(shù)擴增的原理與線性擴增基本相同，只是采用與模板DNA序列完全相同的引物，在酶作用下延伸，其產物作為探針模板；因此，在很短的時間里可以使產物呈現(xiàn)指數(shù)遞增，指數(shù)擴增常用于非環(huán)狀DNA的擴增。

2.5 基因芯片技術

DNA微陣列又稱DNA陣列、DNA芯片、基因芯片，最早出現(xiàn)在80年代中期?；蛐酒幕驹硎请s交測序法，一般來說基因芯片是指帶有適配體涂層的特殊物體；具體地說，基因芯片能夠識別特定基因表達、基因序列，最常見的基因芯片是指將單鏈DNA探針固定在其上的特殊玻璃片。近年來，有越來越多的研究團隊運用基因技術檢測食源性致病菌，Seung Jun Oh等設計制備了圓形微流控芯片，該芯片借助LAMP和鉻黑T光學手段實現(xiàn)了多種致病菌的甄別和檢測[11]。Yong Tae Kim等結合固相萃取、聚合酶鏈式反應和免疫層析技術，構建了多種致病菌的光學檢測體系，檢測過程可在55分鐘內完成，檢測限達5 cell[12]?；蛐酒夹g能夠獲得目標物詳細的基因信息，包括相關識別因子、類型、致病因子和抗生素抗藥性等。但它存在成本高、檢測能力有限、重現(xiàn)性低等缺點，因此，基因芯片技術在致病菌檢測中的運用還需要進一步研究[13]。

3 生物傳感器技術

生物傳感器將生物所固有的識別原件（如酶、抗體、組織、細胞、核酸等）轉換為電、聲、熱、光等信號，可以構建致病菌的分析檢測系統(tǒng)，包括細胞檢測傳感器、熒光標記抗體結合流體細胞技術、表面增強拉曼散射、傅里葉紅外光譜儀、光散射技術等。生物傳感器可用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特菌等檢測。與其他致病菌檢測方法相比，它具有穩(wěn)定性好、選擇性強、靈敏度高、成本低等優(yōu)點，能在復雜體系中進行快速連續(xù)檢測。生物傳感器根據(jù)轉換原理的不同，可分為電化學生物傳感器、 熱學生物傳感器、 光學生物傳感器、壓電生物傳感器和半導體生物傳感器等[14-16]。

4 結論與展望

傳統(tǒng)的微生物鑒定檢測方法主要有分離培養(yǎng)計數(shù)、形態(tài)學觀察、生化鑒定和血清分型，這些方法相對簡單、成本低，但特異性與靈敏度低、耗時費力，難以檢測新型細菌。迄今，被研究的病原菌檢測方法還有代謝學檢測技術、噬菌體識別檢測技術。未來，研究與開發(fā)快速、便捷、信號敏銳的致病菌預處理方法和檢測手段，以發(fā)展簡便、靈敏、價廉、易于推廣使用的方法，具有重要的實際應用價值。

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[責任編輯：楊玉潔]