水稻籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累特性及氮肥調控研究

孫璐璐　朱立楠　鄭冠龍　朱方旭　郭雪冬　Lugo Oke　張忠臣　金正勛（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱　150030；第一作者：sunlulu_1990@163.com；通訊作者：zxjin326@hotmail.com）

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水稻籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累特性及氮肥調控研究

孫璐璐朱立楠鄭冠龍朱方旭郭雪冬Lugo Oke張忠臣金正勛*
（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱150030；第一作者：sunlulu_1990@163.com；*通訊作者：zxjin326@hotmail.com）

摘要：選用5個粳稻品種，通過田間和盆栽試驗，分析水稻籽粒中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的品種間差異和籽粒中分布特點、灌漿過程中積累動態(tài)變化及其與施氮量和谷氨酰胺合成酶活性間的關系。結果表明，精米中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量品種間有顯著差異，銨態(tài)氮含量高于硝態(tài)氮；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮主要分布在籽粒的米糠層里，在籽粒中呈由外到內逐漸降低的變化趨勢；隨著施氮量的增加，精米中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都大幅度增加，增幅高達114.1%～203.0%，但增加的幅度因品種不同而異；隨灌漿進程的推進，籽粒硝態(tài)氮含量逐漸增多直至成熟，但硝態(tài)氮的日積累量和銨態(tài)氮含量隨灌漿進程逐漸上升，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，抽穗后25 d達到峰值，硝態(tài)氮含量高的品種日積累量顯著大于含量低的品種，銨態(tài)氮含量高的品種灌漿前期積累量少于含量低的品種，而灌漿后期的積累量高于含量低的品種；籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間均呈顯著或極顯著正相關。

關鍵詞：水稻；硝態(tài)氮；銨態(tài)氮；積累特性；氮肥調控

已有研究［1-2］表明，硝酸鹽、亞硝酸鹽和生物堿是合成強致癌物質亞硝胺的前體物，人和動物均可利用硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺等含氮物質合成亞硝胺。聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織和糧農(nóng)組織（WHO/FAO）1973年規(guī)定［3］，每kg人體質量的硝態(tài)氮日允許攝入量為0～1.06 mg，亞硝態(tài)氮為0～0.04 mg。歐共體食物科學委員會（SCF）1992年又將亞硝態(tài)氮的允許量降低到0～0.02 mg［4］。

水稻是世界上重要的糧食作物，有約1/2的人口以稻米為主食［5］。中國是世界上水稻總產(chǎn)量最高的國家，同時也是最大的稻米消費國［6］。作物體內的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮主要來自于根吸收的氮肥，大量施用氮肥已成為水稻取得高產(chǎn)更高產(chǎn)的重要手段之一。然而，大量施用氮肥增產(chǎn)的同時，是否會造成水稻籽粒中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮過度積累，進而危害人體健康，迄今未見研究報道。因此，分析水稻籽粒中硝態(tài)氮、銨態(tài)氮分布特點和品種間差異，在灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮積累動態(tài)變化以及與施氮量和氮代謝關鍵酶活性間的關系等對生產(chǎn)安全食用稻米具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試材料與田間試驗設計

選用五優(yōu)稻4號、松粳3號、松粳6號、松粳9號、松粳12號等5個粳稻品種為材料，于2013年在黑龍江省五常市民樂鄉(xiāng)紅光村進行田間試驗。試驗采用裂區(qū)試驗設計，肥料為主區(qū)，品種為副區(qū)，6 m行長，8行區(qū)，3次重復。4月6日播種，播種量為每盤催芽籽150 g，大棚盤育苗。5月15日人工插秧，插秧密度為行距30 cm、株距13 cm，每叢插4棵苗。施氮量設3個水平：不施任何肥料（CK）；施純N 90 kg/hm2（L）；施純N 135 kg/hm2（H）。N∶P2O5∶K2O為1∶0.5∶0.8。磷肥全部作基肥，鉀肥50%作基肥、50%作穗肥。氮肥45%作基肥、25%作分蘗肥、30%作穗肥。其他田間管理同常規(guī)生產(chǎn)。

收獲時以小區(qū)為單位混收脫粒，待自然干燥3個月后磨糙米，糙米經(jīng)1.7 mm分級篩過篩后，使用韓國雙龍公司生產(chǎn)的三立式全自動精米機將糙米分別加工成精米率為85%和90%的精米。用旋渦式粉碎機粉碎糙米和不同精米率的精米，供籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量和全氮含量測定。

1.2盆栽試驗設計

選用五優(yōu)稻4號和松粳6號2個粳稻品種為材料，于2014年在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學校內進行盆栽試驗，盆規(guī)格為長100 cm、寬40 cm、高60 cm。根據(jù)供試品種的生育期進行分期播種，以期使抽穗期盡可能一致，大棚盤育苗，單粒等距離點播催芽籽，5月9日選取長勢一致的秧苗，行距25 cm，株距10 cm，單株插秧，每盆插12棵苗，每個品種插3盆，正常水肥管理。

抽穗時每個供試品種選取長勢相近、且同日抽的穗掛牌標記，待抽穗后的第10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d分別取掛牌標記的稻穗8個，迅速放入液氮中，然后各稻穗中選取灌漿一致的穗中部籽粒30粒，在低溫下去殼去胚后放入凍存管里，置于-80℃冰柜里保存，用于籽粒硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量測定和谷氨酰胺合成酶活性測定。

1.3測定方法

采用張福強［7］改進的酚二磺酸法測定籽粒硝態(tài)氮，采用靛酚藍比色法［8］測定銨態(tài)氮。用半微量凱氏定氮法測定籽粒全氮含量。參照金正勛等［9］方法測定籽粒谷氨酰胺合成酶活性。

表1　品種間精米硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量多重比較

表2　糙米和不同精米率稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量比較?。é蘥/g）

2　結果與分析

2.1精米硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、全氮含量的品種間差異

由表1可見，不同品種間精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量、全氮含量以及硝態(tài)氮與全氮、銨態(tài)氮與全氮、無機氮與全氮的百分比等F值均達到極顯著水平，說明供試品種間這些性狀有極顯著的遺傳差異。進一步多重比較可知，松粳12號硝態(tài)氮含量、松粳6號銨態(tài)氮含量、松粳9號全氮含量分別極顯著高于其他品種，增幅分別比最低的松粳6號和五優(yōu)稻4號高1.6倍、1.3倍和1.1倍；松粳12號硝態(tài)氮與全氮的百分比、松粳6號銨態(tài)氮與全氮的百分比最大，而松粳6號和五優(yōu)稻4號最小，而且差異達到極顯著水平；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量松粳12號都較高，五優(yōu)稻4號都較低，松粳6號是一高一低；硝態(tài)氮含量和硝態(tài)氮與全氮百分比的變異系數(shù)最大，全氮含量變異系數(shù)最小。說明不同基因型品種間稻米積累的硝態(tài)氮量和轉化能力有顯著的差異，其積累量高低受控于遺傳基因，而且品種間稻米硝態(tài)氮含量變異遠大于銨態(tài)氮含量的變異。

2.2糙米和不同精米率稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量比較

由表2可見，五優(yōu)稻4號和松粳6號糙米的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量最高，其次是90%精米率的稻米，而85%精米率的稻米最低，其差異都達到極顯著水平。與糙米相比，90%精米率的五優(yōu)稻4號和松粳6號稻米硝態(tài)氮含量分別降低46.5%和45.3%，銨態(tài)氮含量分別降低82.5%和78.5%；85%精米率的稻米硝態(tài)氮含量分別降低69.4%和68.0%，銨態(tài)氮含量分別降低86.8%和85.7%；與90%精米率的稻米相比，85%精米率的稻米硝態(tài)氮含量分別降低42.8%和41.5%，銨態(tài)氮含量分別降低24.8%和33.6%。說明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量是由籽粒表層到內逐漸降低。

由表2還可見，五優(yōu)稻4號的糙米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都高于松粳6號，但90%精米率的稻米中硝態(tài)氮含量是五優(yōu)稻4號高于松粳6號，而銨態(tài)氮含量是松粳6號高于五優(yōu)稻4號，當糙米加工成85%精米率時2個品種間硝態(tài)氮含量沒有差異，銨態(tài)氮含量差異較小。

2.3施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮及全氮含量的影響

表3　施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮及全氮含量的影響

表4　灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量變化?。é蘥/g）

由表3可見，5個粳稻品種精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均隨施氮量的增加而極顯著上升，全氮含量雖然因品種不同既有顯著增加的，如五優(yōu)稻4號、松粳3和松粳9號，也有差異不大的，如松粳6號無肥和低肥處理間、松粳12號低肥和高肥處理間差異都不顯著，但總體上看還是增加的。與對照相比，當施氮量為90 kg/ hm2時，硝態(tài)氮含量增幅為66.18%～90.52%，平均增加74.90%；銨態(tài)氮含量增幅為9.47%～50.84%，平均增加30.42%；全氮含量增幅為1.66%～6.44%，平均提高3.60%；當施氮量為135 kg/hm2時，硝態(tài)氮含量增幅為114.1%～203.0%，平均提高169.2%；銨態(tài)氮含量增幅為52.33%～99.31%，平均增加78.80%；全氮含量增幅為4.13%～11.58%，平均提高6.63%。與施氮量90 kg/hm2相比，當施氮量135 kg/hm2時，硝態(tài)氮含量增幅達28.83%～75.02%，平均增加53.73%；銨態(tài)氮含量增幅達11.15%～77.18%，平均增加39.11%；全氮含量增幅達1.02%～4.82%，平均提高2.92%。說明施氮量對精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量影響很大，隨著施氮量的增加精米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量都大幅度地增加，而且增加的幅度因品種不同而異，全氮含量雖然顯著增加，但增加幅度較小。

2.4灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累動態(tài)變化

由表4可見，灌漿過程中五優(yōu)稻4號和松粳6號籽粒硝態(tài)氮含量變化趨勢都一致，表現(xiàn)為隨灌漿進程積累量逐漸增多直至成熟，但日積累的量是隨灌漿進程逐漸上升，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，2個品種都在抽穗后25 d達到峰值，而且硝態(tài)氮含量高的品種五優(yōu)稻4號日積累量和灌漿同時期硝態(tài)氮含量顯著或極顯著高于含量低的品種松粳6號。說明灌漿過程中籽粒硝態(tài)氮積累量是隨灌漿進程持續(xù)增加，灌漿時間越長積累的量也越多，而且含量高的品種具有更快的積累速度。

灌漿過程中五優(yōu)稻4號和松粳6號籽粒銨態(tài)氮含量均隨灌漿進程逐漸增加，達到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，都在抽穗后25 d達到峰值，抽穗后10 ～25 d籽粒中的銨態(tài)氮含量松粳6號極顯著高于五優(yōu)稻4號，但抽穗后30～35 d卻相反。說明灌漿成熟過程中不同品種間籽粒銨態(tài)氮代謝在時間和程度上均有差異，銨態(tài)氮含量高的品種灌漿前期積累量少于含量低的品種，而灌漿后期含量高的品種積累量多于含量低的品種。

2.5籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累關系

由表5可見，水稻灌漿過程中，2個品種的籽粒谷氨酰胺合成酶活性變化趨勢基本一致，表現(xiàn)為隨著灌漿進程酶活性逐漸上升，達到峰值后又逐漸降低，但仍然維持與灌漿中前期同樣的水平，呈單峰曲線變化，五優(yōu)稻4號和松粳6號分別在抽穗后30 d和25 d到達峰值，說明酶活性達到峰值的時間因品種而異。就酶活性高低而言，抽穗后10～25 d的谷氨酰胺合成酶活性松粳6號顯著或極顯著高于五優(yōu)稻4號，但抽穗后30～35 d卻是五優(yōu)稻4號極顯著高于松粳6號，說明既有灌漿中前期酶活性大的品種，也有灌漿中后期酶活性大的品種。

由表6可見，灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間均呈正相關。其中，松粳6號的硝態(tài)氮含量、五優(yōu)稻4號的硝態(tài)氮日積累量與谷氨酰胺合成酶活性的相關性未達顯著水平外，其他均達到顯著或極顯著水平。說明籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間有密切關系，酶活性高有利于促進硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的積累。

表5　灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性變化?。║/grain）

3　討論

谷氨酰胺合成酶是氮代謝過程中具有多功能的酶，參與調控很多氮代謝的過程。谷氨酰胺合成酶活性的降低可導致植物體內很多氮代謝及糖代謝過程受到影響。張亞麗等［10］研究表明，不同品種對硝態(tài)氮吸收存在著明顯的基因型差異。Larmur等［11］研究表明，不同品種間植株氮的再轉運速率差異明顯。本試驗結果表明，不同品種間稻米硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量存在很大的遺傳差異，籽粒中硝態(tài)氮含量高的品種具有更快的積累速度，積累量和速度都取決于品種的遺傳特性；灌漿過程中籽粒谷氨酰胺合成酶活性與硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及硝態(tài)氮日積累量間有密切關系，酶活性高有利于促進硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的積累，而且不同灌漿時期和品種間酶活性大小有極顯著的遺傳差異。這就說明，稻米積累硝態(tài)氮和銨態(tài)氮量的多少取決于品種的遺傳特性，積累量高的品種具有相關的高功能基因和酶活性。徐振華［12］研究表明，品種間有性雜交后代籽粒谷氨酰胺合成酶活性能產(chǎn)生超親變異，而且酶活性高低與該基因mRNA表達量有密切關系，也進一步說明基因在氮代謝和硝態(tài)氮積累上起重要的調控作用。因此，通過品種間雜交育種和基因操作等選育籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量低的品種是生產(chǎn)綠色安全稻米的最經(jīng)濟有效的途徑。

另外，過量施用氮肥所導致的蔬菜硝態(tài)氮吸收與還原轉化不平衡是產(chǎn)生累積的根本原因，吸收與生長不協(xié)調更使累積過程加劇［13］。由本試驗結果可知，不施氮肥生產(chǎn)的精米中硝態(tài)氮含量較低，但隨著施氮量的增加，精米中硝態(tài)氮含量大幅度增加，其增幅高達114.1%～203.0%。這就說明，單施過量的氮肥和不合理的施用是促進作物硝態(tài)氮積累的重要原因。前人的研究結果表明，不施氮處理的玉米植株硝態(tài)氮含量低于施氮處理［14］；硼鉬脅迫將抑制大豆葉片硝酸還原酶活性，增加硝態(tài)氮含量［15］；在菠菜中鉀素含量高的器官，硝態(tài)氮還原轉化速度快，氮肥和鉀肥配施可以降低蔬菜的硝態(tài)氮含量［16-17］；抽穗后25 d時增施磷肥和鉀肥的處理籽粒非蛋白氮含量下降［18］，表明不同營養(yǎng)元素對作物氮素吸收利用和積累都起不同的作用。從本試驗結果也可知，不同灌漿時期籽粒中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮積累的量和速度不僅品種間有顯著的遺傳差異，而且隨施氮量的增加，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮增加的幅度因品種和施氮量不同而異。因此，在綠色優(yōu)質高產(chǎn)水稻栽培中不僅要控制氮肥施用量，而且還應根據(jù)品種對氮素營養(yǎng)的反應特性，更加注意氮肥施用時期及配施其他元素肥料，以協(xié)調水稻籽粒灌漿成熟過程中的碳氮代謝，充分發(fā)揮其籽粒積累淀粉和蛋白質的生理功能，促進非蛋白氮的轉化是降低籽粒硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的重要調控途徑。

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Study on Accumulation Characteristics of Nitrate-N and Ammonia-N in Grain of Rice and Regulation of N-fertilizer

SUN Lulu，ZHU Linan，ZHENG Guanlong，ZHU Fangxu，GUO Xuedong，Lugo Oke，ZHANG Zhongchen，JIN Zhengxun*
（Agricultural College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；1st autor：sunlulu_1990@163.com；*Corresponding author：zxjin326@hotmail.com）

Abstract：Based on the field and pot culture experiment of five japonica rice varieties，the content and distribution character of nitrate-N and ammonia-N in the endosperm，their variable trend during the grain filling period and the correlations of N-fertilizer with the enzyme activity of GS among different varieties were analyzed.The results indicated that there was a difference between nitrate-N and ammonia-N content in the mature grain among the rice varieties.The content of ammonia-N is higher than nitrate-N，which both mainly located in rice bran and showed a decline trend from outside to inside.Increasing the N-fertilizer amount led to the increase in the nitrate-N and ammonia-N level by 114.1%～203.0%depending on different varieties；As application of N-fertilizer level raised，each content showed a significant growth.During the filling period，the nitrate-N content in endosperm kept raising until the mature stage，while the accumulation amount of nitrate-N and the content of ammonia-N showed a unimodal curve trend with peak value appearring at the 25th day after heading.Comparing with low nitrate-N content varieties，the daily average growth of nitrate-N was extremely higher than the high content varieties.However，the daily average growth of ammonia-N was lower than the high ammonia-N content varieties at early grain filling stage，but higher at late stage than the low Ammonia-N content varieties.The enzyme activity of GS showed significant difference among different variaties at each stage，having a outstanding positive linear correlation to the content and accumulation rate of ammonia-N and nitrate-N.

Key words：rice；nitrate-N；ammonia-N；accumulation characteristics；N-fertilizer regulation

中圖分類號：S511

文獻標識碼：A

文章編號：1006-8082（2016）01-0025-05

收稿日期：2015－09－21

基金項目：科技部“十二五”科技支撐計劃項目（2011BA D16B11-02YJ02）；“十二五”農(nóng)村領域國家科技支撐計劃項目（2013BAD20B04-2S）