微小RNA-126在食管癌組織中的表達(dá)及其對食管癌EC109細(xì)胞增殖和遷移的影響

呂會來　張　麗　溫士旺　張月峰　李　勇　田子強

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸五科，河北　石家莊　050091)

微小RNA-126在食管癌組織中的表達(dá)及其對食管癌EC109細(xì)胞增殖和遷移的影響

呂會來張麗1溫士旺張月峰李勇田子強

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸五科，河北石家莊050091)

〔摘要〕目的探討微小RNA(miRNA)-126在食管癌組織中的表達(dá)及其對食管癌EC109細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法收集該院胸外科手術(shù)切除且保存完整的食管癌及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本30例，通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測癌組織和癌旁組織中miRNA-126 mRNA表達(dá)；miRNA-126 mimi和control轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，設(shè)置陰性對照組(轉(zhuǎn)染miRNA mimic control)、轉(zhuǎn)染組、空白對照組(僅轉(zhuǎn)染試劑)，PCR檢測轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞miRNA-126表達(dá)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng) 1、3、5 d 后MTT檢測細(xì)胞增殖情況，Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移活力。結(jié)果癌組織中miR-126 mRNA低于癌旁組織(P<0.05)；轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞后miRNA-126在陰性對照組和空白對照組表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；三組轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞OD值均逐漸升高(P<0.05)，培養(yǎng)第3、5天細(xì)胞OD值組間差異顯著(P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染組EC109細(xì)胞OD值均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞遷移活力檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組OD值低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)。結(jié)論食管癌組織中miRNA-126低表達(dá)，并且對食管癌EC109細(xì)胞增殖和遷移具有一定抑制作用。

〔關(guān)鍵詞〕食管癌；微小RNA-126：細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療對食管癌患者預(yù)后至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)與腫瘤、心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。miRNA-126主要位于表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域基因的7號內(nèi)含子。目前已有研究表明，miRNAs(miRNA-21，miRNA-133a、miRNA-138等)表達(dá)失調(diào)對食管癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，而對于miRNA-126與食管癌研究較少。本文旨在探究miRNA-126對食管癌發(fā)生及EC109細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院胸外科2012年1月至2015年1月手術(shù)切除的食管癌患者的癌組織以及相應(yīng)癌旁組織(距離癌組織5 cm以外)標(biāo)本30例，食管癌患者經(jīng)病理確診，排除術(shù)前接受放化療者，男18例，女12例，鱗癌23例，腺癌7例，所有標(biāo)本均保存完好，可以收集到患者完整手術(shù)和檢測資料，本次研究符合家庭倫理道德，并且家屬或者患者簽署知情同意書等。

1.2實驗材料人EC109細(xì)胞購自上海研域生物科技有限公司，澳洲胎牛血清(FBS)，RPMI-1640培養(yǎng)基，雙抗購自南京建成生物研究所；人micrON?miRNA-126 mimic和micrON?miRNA mimic control均購自廣州市銳博生物科技有限公司。Trizol總的RNA抽取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒、TaKaRa RNA kit購自大連寶生物工程有限公司。Polytrans高效轉(zhuǎn)染試劑購自武漢維諾賽生物技術(shù)公司。噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海碧云天生物科技公司；Transwell 小室購自美國 Corning 公司。實驗所使用的各種儀器、用具均由我院實驗室提供。

1.3研究方法

1.3.1引物設(shè)計引物的設(shè)計和合成均由金斯瑞生物科技有限公司承擔(dān)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。miRNA-126：正義5′AAGAAGCCAGCCCACAAGG-3′,反義5′CTGGCGGAGGAGAATCAGTC-3′；GAPDH：正義5′ACTTGCCTCGAAGCCATCAA-3,反義5′GGGTGGAGTCGTACTTGAGC-3。

1.3.2食管癌組織和癌旁組織miRNA-126表達(dá)取適量癌組織和癌旁組織進(jìn)行總RNA提取，應(yīng)用紫外分光光度儀分別測定A260和A280值以確定所提取的RNA純度(RNA純品OD260/OD280在1.8～2.0)，置-80℃保存待用，所有的步驟都嚴(yán)格按照Trizol總的RNA抽取試劑盒操作說明進(jìn)行。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，置于-20℃保存?zhèn)溆?。引物使用前按照要求稀釋所需濃度，按照RT-PCR試劑盒要求步驟嚴(yán)格進(jìn)行，加完試劑后PCR儀進(jìn)行檢測，按照二步法進(jìn)行，反應(yīng)條件為預(yù)變性：95℃，30 s，1個循環(huán)。PCR擴(kuò)增：95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環(huán)。

1.3.3miRNA-126 mimic和control轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞以及PCR檢測miRNA-126EC109細(xì)胞接種于含有15% FBS、1 ml雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶80%后，將對數(shù)期生長良好經(jīng)過消化按照1×106個/孔接種于6孔板中，每孔加入3 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞過夜觀察細(xì)胞融合50%左右，按照Polytrans高效轉(zhuǎn)染試劑要求步驟轉(zhuǎn)染miRNA-126 mimic于EC109細(xì)胞，實驗設(shè)置陰性對照組(轉(zhuǎn)染miRNA mimic control)、轉(zhuǎn)染組、空白對照組(僅轉(zhuǎn)染試劑)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后狀態(tài)，利用總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR試劑盒按照說明書要求步驟嚴(yán)格進(jìn)行，檢測各組中miRNA-126表達(dá)。

1.3.4轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞增殖和遷移活性檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)，將對數(shù)期生長良好的細(xì)胞，按照7 000個/200 μl/孔接種于96孔板，每組均設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置凋零組(只加培養(yǎng)液)，按照實驗設(shè)計分別培養(yǎng) 1、3、5 d 后，避光每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，吸去上清液，按照150 μl/孔加入DMSO，輕振蕩后，在酶標(biāo)儀550 nm波長處檢測，各組吸光度(OD)，細(xì)胞增殖率=(實驗組-凋零組)/(空白對照組-凋零組)×100%。應(yīng)用Transwell 小室法檢測轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞遷移活力，將Transwell小室放入24孔板中，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，將細(xì)胞按照50 000個/孔接種于上室。腫瘤細(xì)胞常用8.0、12.0 µ膜上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞培養(yǎng)20 h后取出Transwell小室將內(nèi)面擦凈，甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，以33%乙酸溶液溶解結(jié)晶紫，酶標(biāo)儀532 nm測量OD值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1食管癌組織和癌旁組織中miR-126 mRNA 的表達(dá)水平癌組織中miR-126 mRNA的相對表達(dá)量(0.42±0.07)與癌旁組織(1.01±0.04)差異顯著(t=3.452，P=0.026)。

2.2miRNA-126 mimic轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞miRNA-126表達(dá)PCR檢測miRNA-126表達(dá)，其中陰性對照組為1.04±0.07，空白對照組為1.10±0.07，轉(zhuǎn)染組為57.37±12.15，差異顯著(F=6.785，P=0.000)，其中陰性對照組和空白對照組表達(dá)量分別與轉(zhuǎn)染組相比差異顯著(t=5.675、4.882，P=0.025、0.017)，陰性對照組和空白對照組相比無差異(t=0.563，P=0.238)。

2.3miRNA-126 mimic對轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞增殖影響三組轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞OD值均逐漸升高(P<0.05)，培養(yǎng)第1天三組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，培養(yǎng)第3、5天差異顯著(P<0.05)，其中轉(zhuǎn)染組EC109 細(xì)胞OD值均低于陰性對照組和空白對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組無差異(P>0.05)。見表1。

表1　三組轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞不同培養(yǎng)時間OD比較±s)

與轉(zhuǎn)染組比較：1)P<0.05

2.4miRNA-126 mimic對轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞遷移的影響酶標(biāo)儀532 nm測量經(jīng)過33%乙酸溶液溶解結(jié)晶紫OD值，轉(zhuǎn)染組為(0.31±0.05)，陰性對照組為(0.45±0.09)，空白對照組為(0.48±0.07)，差異顯著(F=3.179，P=0.041)，其中轉(zhuǎn)染組OD值低于陰性對照組為和空白對照組(t=3.455、3.586，P=0.035、0.032)，對照組和空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.235，P=0.085)。

3討論

miRNAs是具有調(diào)控功能的非編碼RNA〔2〕，一系列核酸酶剪切修飾，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，通過堿基互補配對識別靶mRNA 3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3′UTR)負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，并且互補程度指導(dǎo)RISC降解或者抑制靶mRNA翻譯，大量研究發(fā)現(xiàn)〔3〕miRNA參與各種調(diào)節(jié)途徑，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)。目前為止，只有小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明，比如miR-273和lys-6編碼的miRNA，參與線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程〔4〕；miR-430參與大腦發(fā)育〔5〕；miR-181血細(xì)胞分化為B細(xì)胞〔6〕；miR-375調(diào)胰島細(xì)胞發(fā)育和胰島素分泌〔7〕；miR-143在脂肪細(xì)胞分化起作用；miR-196參與了哺乳動物四肢形成，miR-1與心臟發(fā)育有關(guān)等。最近研究發(fā)現(xiàn)〔8〕miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，大約50%得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點，說明miRNAs在腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。

有研究報道m(xù)iRNA-21、miRNA-16、miRNA-25、miRNA-199等〔9〕均在食管癌組織中高表達(dá)，miRNA-133a、miRNA-138、miRNA-195、miRNA-200b等〔10〕在食管癌組織中低表達(dá)。本研究說明miRNA-126基因可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要抑制作用，是抑癌因子。miRNA在調(diào)節(jié)食管癌生物特點同樣起著重要作用，研究將miRNA前體序列、類似物等轉(zhuǎn)染后相應(yīng)食管癌細(xì)胞能上調(diào)miRNA，提示可以通過此特性檢查食管癌細(xì)胞變化情況。

miRNA-126可以抑制食管癌細(xì)胞增殖和遷移，本研究說明轉(zhuǎn)染后miRNA-126的表達(dá)可能抑制食管癌細(xì)胞增殖，并且細(xì)胞增殖幅度小于對照組等；另外，經(jīng)轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞遷移活力減弱，與其他miRNA在食管癌中作用類似，這可能與miRNA-126和靶基因結(jié)合有關(guān)。決定區(qū)丫框蛋白2(SOX2)是miR-126主要靶基因，SOX2靶基因可能在miR-126影響細(xì)胞遷移和增殖中起著重要作用，對于具體機制還需要進(jìn)一步深入研究。

食管癌組織中miRNA-126低表達(dá)，且對EC109細(xì)胞增殖和遷移有抑制作用，但是miRNA-126在食管癌組織和細(xì)胞中作用是通過哪種途徑或者靶基因還需要進(jìn)一步深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-07-10修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(No.20150303)

通訊作者：田子強(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2332-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.009

1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院干部病房

第一作者：呂會來(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤基礎(chǔ)與臨床方面的研究。