凡納濱對(duì)蝦新過敏原烯醇化酶的鑒定

談思怡　黃建芳　孫一帆　郭成斌　向軍儉

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心 暨南大學(xué)廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州市疾病與食品安全免疫學(xué)快速檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510632)

凡納濱對(duì)蝦新過敏原烯醇化酶的鑒定

談思怡黃建芳孫一帆郭成斌向軍儉

(暨南大學(xué)抗體工程研究中心 暨南大學(xué)廣東省分子免疫與抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州市疾病與食品安全免疫學(xué)快速檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510632)

[摘要]目的：鑒定凡納濱對(duì)蝦分子量為47 kD過敏原的性質(zhì)。方法：采用丙酮沉淀法提取凡納濱對(duì)蝦總蛋白，通過SDS-PAGE、11例蝦過敏患者血清IgE的Western blot 分析凡納濱對(duì)蝦中過敏原組份，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Matrix-Assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS)鑒定凡納濱對(duì)蝦47 kD未知過敏原組分。結(jié)果：通過 SDS-PAGE電泳證明所提取的凡納濱對(duì)蝦總蛋白組分完全。Western blot 結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦至少有14種與陽(yáng)性血清反應(yīng)的組分，其中，55%的蝦過敏患者IgE與分子量為47 kD的蛋白分子發(fā)生特異性反應(yīng)，質(zhì)譜分析結(jié)果顯示47 kD蛋白為烯醇化酶。結(jié)論：烯醇化酶是凡納濱對(duì)蝦的一種新的過敏原。

[關(guān)鍵詞]凡納濱對(duì)蝦；過敏原；烯醇化酶；質(zhì)譜；Western blot

食物過敏現(xiàn)象已經(jīng)成為一個(gè)常見的公共衛(wèi)生問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)在發(fā)達(dá)國(guó)家食物過敏影響了大約2%成年人和8%兒童的日常生活甚至生命安全[1]。甲殼類食物作為糧食農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)認(rèn)定的八大過敏食物之一[2]。在一些沿海國(guó)家例如中國(guó)、日本，因食用甲殼類食物而導(dǎo)致食物過敏的患者逐年增多[3]。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是當(dāng)今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一，是我國(guó)南方地區(qū)的主要養(yǎng)殖蝦種。由于其卡路里含量低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高而深受人們的喜愛[4]。因此，由其引起的食物過敏在我國(guó)也較為常見。1981年在蝦中確定了第一個(gè)過敏原，38～41 kD的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)，是蝦中最主要的過敏原；其他已被證實(shí)的重要過敏原還包括40 kD的精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)、20 kD的肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain,MLC)、20～22 kD的肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白(Sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)及75 kD的血藍(lán)蛋白(Hemocyanin，Hc)；除此之外，一些次要過敏原如：21 kD的鈣肌蛋白C(Troponin C,Tn C)、28 kD的磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triose Phosphate isomerase,TIM)、225 kD的肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain，MHC)等也相繼被鑒定[5-7]。

在前期研究工作中，通過對(duì)蝦過敏患者血清樣本分析，我們發(fā)現(xiàn)除了已明確的幾個(gè)過敏原外，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)中的47 kD蛋白組分也具有較高的血清IgE反應(yīng)率，且顏色較深[8]。繼而，本研究旨在探討凡納濱對(duì)蝦中是否存在新的過敏原，為進(jìn)一步豐富蝦過敏原組分的認(rèn)識(shí)提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自廣州黃沙水產(chǎn)市場(chǎng)；蛋白 Mr marker購(gòu)自Thermo公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；HRP 標(biāo)記羊抗人IgE 二抗購(gòu)自Bethly公司；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自弗德生物；胰酶購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；垂直板型電泳儀、膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自Bio-Rad公司；低溫高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppdof公司；4800 PLUS MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1凡納濱對(duì)蝦總蛋白的提取取新鮮的活蝦去頭去殼后取肌肉組織，用組織搗碎機(jī)搗碎。參照《變態(tài)反應(yīng)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[9]中的方法，將搗碎的組織用50%預(yù)冷丙酮浸泡，4℃攪拌4 h，8 500 r/min離心15 min，收集沉淀。重復(fù)脫脂一次。沉淀物置于通風(fēng)櫥室溫徹底風(fēng)干后，浸入0.1 mol/L PBS(pH7.4)中，4℃攪拌1 h，靜置過夜，12 000 r/min 4℃離心20 min取上清；用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，分裝后于-20℃儲(chǔ)存。

1.2.2血清來(lái)源蝦過敏患者血清5份來(lái)自暨南大學(xué)在校師生過敏患者， 6份來(lái)自廣東省婦幼保健醫(yī)院的蝦過敏患者，共11份?；颊吣挲g1～40歲，其中男性6例，女性5例，陽(yáng)性血清納入標(biāo)準(zhǔn)為患者有典型的食物過敏史，臨床確診為蝦過敏患者。陰性對(duì)照血清2份，男女志愿者等比例，年齡分別為26歲、22歲，納入標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)家族過敏史，無(wú)食物過敏史。將采集的血液37℃靜置30 min后4℃靜置過夜，2 000 r/min 離心10 min，分裝后于-20℃儲(chǔ)存。

1.2.3SDS-PAGE電泳分析配置12%的分離膠，5%的濃縮膠；蝦蛋白樣品與上樣緩沖液1∶5混合，煮沸5～10 min變性，取適量樣品上樣。80 V，30 min恒壓使樣品在濃縮膠中壓縮成一條線，120 V恒壓電泳分離，以溴酚藍(lán)為指示，當(dāng)其跑至終點(diǎn)后停止電泳。用考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色2～4 h后，脫色液脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶。

1.2.4Western blot分析蝦蛋白粗提液經(jīng)SDS-PAGE分離后，100 V恒壓，60 min 用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠中用的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉 37℃封閉2 h，PBST 洗滌三次，每次10 min。人血清用PBS-T 稀釋10倍，37℃ 孵育2 h，PBST洗滌三次，每次10 min。HRP標(biāo)記羊抗人IgE 二抗(1∶1 000)37℃ 孵育1 h，PBST 洗滌三次，每次10 min。加入Ecl化學(xué)發(fā)光試劑，凝膠成像系統(tǒng)曝光后掃描保存結(jié)果。

1.2.5質(zhì)譜鑒定與分析凡納濱蝦蛋白粗提液進(jìn)行SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍(lán)G-250染色、脫色，將目的蛋白條帶切成膠粒進(jìn)行膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解，提取肽段用ABI4800 MALDI-TOF/TOF-MS串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行指紋圖譜(PMF)檢測(cè)，質(zhì)譜操作采用正離子反射模式,質(zhì)譜分析使用標(biāo)準(zhǔn)肽混合物作為外標(biāo)校正，從一級(jí)質(zhì)譜中選擇信噪比大于50的得分最高的前體離子做MS/MS分析，然后進(jìn)行IPI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，搜索的參數(shù)設(shè)置如下：種類為蝦，切割酶 Trypsin， 允許最大漏切位點(diǎn)數(shù)(Missed cleavage)為 1，可變修飾為cysteine carboamido methylated和methionine oxidized，無(wú)固定修飾。MS 的誤差 100 ppm，MS/MS 的誤差為0.6 Da。得分超過53被認(rèn)為超過閾值(P≤0.05)，為可信的鑒定結(jié)果。

2結(jié)果

2.1凡納濱對(duì)蝦總蛋白組分分析蝦蛋白粗提液按16 μg上樣的SDS-PAGE，結(jié)果如圖1所示，至少有14條明顯的蛋白條帶。其中分子量為20、38、40、75 kD分別為已知的過敏原肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶及血藍(lán)蛋白。

2.2Western blot鑒定過敏原組分過敏患者血清IgE與凡納濱對(duì)蝦蛋白粗提液進(jìn)行Western blot，2 例無(wú)過敏史的健康人血清做陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，除分子量為38 kD的原肌球蛋白、40 kD的精氨酸激酶及75 kD的血藍(lán)蛋白外，在11例過敏患者中，有6例患者血清IgE能與分子量為47 kD的蛋白分子發(fā)生特異性反應(yīng)，反應(yīng)率為 55%,且反應(yīng)條帶明顯。說明分子量為47 kD蛋白是凡納濱對(duì)蝦的過敏原之一(圖2)。

圖1　凡納濱對(duì)蝦總蛋白SDS-PAGEFig.1　SDS-PAGE of proteins from Litopenaeus vannameiNote: M.Protein marker ；1.Litopenaeus vannamei.

表1匹配片段質(zhì)譜分析結(jié)果

Tab.1MALDI-TOF/TOF results of matched peptides

ObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaStartEndMissIonsPeptide2331.13452330.12722330.11080.01641210133-.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M2331.13452330.12722330.11080.01641210--.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M1769.02261768.01531767.87600.139422361-R.LVVCACYRLSVSDAR.N1782.90391781.89661781.78330.113337501-R.NCCIKFGSCCHLVK.-1230.71131229.70401229.69790.006126361-K.QTGLEQSVKIK.K2283.15012282.14282282.07360.06921461641-R.LSNEKAYQEINDTQEMIEK.I1895.03451894.02721893.88120.14611341491-R.SMLDEERMDALESQLK.E2331.13452330.12722330.21910.09192232431-K.IVLMHDIYATSADAAEEIIKK.L1895.03451894.02721893.90430.12302692850-R.ACYAVSVAVQNYHGIDK.D

圖2　凡納濱對(duì)蝦蛋白粗提液與患者血清 IgE的Western blot鑒定Fig.2　Identification of allergens in crude extracts by Western blotNote: M.Protein marker;1-2.Negative controls;3-8.Allergic patients′ serum.

2.3質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果凡納濱對(duì)蝦47kD過敏原經(jīng)胰蛋白酶酶切后的肽段混合物進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖3、表1。圖3A為該蛋白的一級(jí)質(zhì)譜，從一級(jí)質(zhì)譜圖中選擇強(qiáng)度較高的肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到的MS/MS 圖譜經(jīng)檢索，最終給出了Mowse分值(圖3B)。凡納濱對(duì)蝦47 kD過敏原與巖蝦屬的烯醇化酶高分值匹配。普庫(kù)索取號(hào)為gi:344049993，Mascot得分為142，覆蓋率達(dá)15%，等電點(diǎn)4.42。結(jié)果表明凡納濱對(duì)蝦47 kD過敏原為烯醇化酶。

3討論

烯醇化酶是催化2-磷酸-甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反應(yīng)的酶，屬于糖酵解體系，在細(xì)胞能量代謝過程中起重要的作用。Nahm等人發(fā)現(xiàn)α-烯醇化酶作為體內(nèi)自身抗原可以引起嚴(yán)重哮喘[10]。Nittner等人通過皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)證明啤酒酵母中的主要過敏原為烯醇化酶，可誘發(fā)呼吸道過敏反應(yīng)[11]；烯醇化酶被認(rèn)為是一類高度保守的真菌過敏原[12,13]。Liu采用雙向結(jié)合質(zhì)譜分析手段從武昌魚中鑒定出兩種新的過敏原即烯醇化酶和肌酸激酶[14]。近期德國(guó)學(xué)者也從鱈魚、鮭魚和金槍魚中確認(rèn)魚烯醇化酶和醛縮酶是新的重要的魚過敏原。在魚類過敏診斷中IgE與烯醇化酶和醛縮酶特異結(jié)合，尤其是在小清蛋白缺乏時(shí)[15]。此外，烯醇化酶作為過敏原在德國(guó)小蠊中也被發(fā)現(xiàn)[16]。

圖3　凡納濱對(duì)蝦 47 kD過敏原蛋白的肽指紋圖譜Fig.3　Identification of shrimp allergen at 47 kD by mass spectrometrNote: A.Peptide mass finger print of suspected protein;B.Probability based mowse score.

在甲殼類過敏原研究中，有文章發(fā)現(xiàn)一蛋白點(diǎn)與磷酸丙酮酸水合酶和烯醇化酶兩種蛋白相匹配，兩種蛋白的相似度可達(dá) 99%，其中肽段198Gly-Lys221與40多個(gè)物種的烯醇化酶相匹配，可作為烯醇化酶的通用特征肽和磷酸丙酮酸水合酶的特征肽[17]，暗示烯醇化酶可能為一種過敏原。2014年泰國(guó)學(xué)者也通過質(zhì)譜分析技術(shù)在墨吉明對(duì)蝦肌肉組織中發(fā)現(xiàn)了47 kD的烯醇化酶可能是一種未見報(bào)道的蝦過敏原[18]。

本研究從凡納濱對(duì)蝦中分離出能與蝦過敏患者血清反應(yīng)的47 kD蛋白組分，通過蛋白組學(xué)質(zhì)譜鑒定方法，證明凡納濱對(duì)蝦47 kD蛋白組分為烯醇化酶，這也肯定了國(guó)外學(xué)者的相關(guān)報(bào)道[18]。作為一種新的蝦過敏原，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)分析鑒定結(jié)果，約55% 蝦過敏患者IgE與烯醇化酶過敏原發(fā)生特異性反應(yīng)，初步可以證明烯醇化酶是凡納濱對(duì)蝦過敏原之一。但受到樣本數(shù)量的限制，烯醇化酶是否為凡納濱對(duì)蝦的主要過敏原還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究進(jìn)一步豐富了對(duì)凡納濱對(duì)蝦過敏原組分的認(rèn)識(shí)，為探尋新的蝦過敏原檢測(cè)試劑、及脫敏疫苗的研發(fā)提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2016-03-02修回2016-03-29]

(編輯許四平)

Identification of a new shrimp allergen enolase from Litopenaeus vannamei

TAN Si-Yi，HUANG Jian-Fang ，SUN Yi-Fan，GUO Cheng-Bin，XIANG Jun-Jian.

Antibody Engineering Research Center of Ji′nan University,Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Guangzhou Key Laboratory of Disease and Food Safety Rapid Test，Guangzhou 510632，China

[Abstract]Objective:To identify enolase,47 kD allergen,from Litopenaeus vannamei by Mass spectrometry.Methods: The proteins were extracted from Litopenaeus vannamei tissue with acetone precipitation method.The protein components were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.By using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS),the 47 kD allergen from Litopenaeus vannamei was identified as enolase.Results: By SDS-PAGE,we proved that the native protein components from Litopenaeus vannamei were completely.According to the Western blot result more than 14 components could react with the positive serum.MALDI-TOF/TOF analysis results showed that the suspected proteins were enolase.A sensitization frequency was 55%.Conclusion: Enolase was identified as a new allergen of Litopenaeus vannamei.

[Key words]Litopenaeus vannamei;Allergen;Enolase;Mass spectrometry;Western blot

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.008

作者簡(jiǎn)介：談思怡(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫及食物過敏原方面研究。 通訊作者及指導(dǎo)教師：向軍儉(1952年-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事工程抗體及其應(yīng)用和過敏原研究，E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

中圖分類號(hào)R392.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)06-0808-04