防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織乙酰肝素酶表達(dá)的影響*

符　強(qiáng)　黃亞仙　王聞婧（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱50040；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢43006）

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防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織乙酰肝素酶表達(dá)的影響*

符強(qiáng)1黃亞仙1王聞婧2△
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430061）

【摘要】目的觀察防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎小球?yàn)V過功能的作用，探討該方減少蛋白尿，治療腎小球疾病的可能機(jī)制。方法尾靜脈注射阿霉素法建立阿霉素腎病大鼠模型，成模后，根據(jù)24 h尿蛋白定量隨機(jī)分為模型組、防己黃芪湯高、低劑量治療組，連續(xù)給藥5周，分別測(cè)定各組大鼠24 h尿蛋白定量及腎組織乙酰肝素酶（HPA）表達(dá)。結(jié)果模型組大鼠24 h尿蛋白定量和腎組織HPA表達(dá)升高明顯高于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，防己黃芪湯高、低劑量治療組24 h尿蛋白定量和腎組織HPA表達(dá)均明顯改善（P＜0.05）。結(jié)論防己黃芪湯減少模型大鼠尿蛋白的作用可能與調(diào)節(jié)腎組織HPA表達(dá)，保護(hù)足細(xì)胞受損有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】阿霉素腎病防己黃芪湯乙酰肝素酶

研究表明，防己黃芪湯在治療慢性腎臟病方面可通過修復(fù)受損腎小球?yàn)V過屏障，恢復(fù)濾過功能，達(dá)到保護(hù)腎功能的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察該方對(duì)阿霉素腎病大鼠24 h尿蛋白定量、腎組織乙酰肝素酶（HPA）表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)Wistar雄性大鼠，48只，體質(zhì)量100～150g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物與試劑防己黃芪湯組成及劑量：防己20g，黃芪25 g，白術(shù)7.5 g，炙甘草10g。上述飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供，加水500mL，浸泡30min，煎煮30min，濾出藥渣，再次加水400min煎煮45 min，將2次煎取液合并混勻，恒溫60℃條件下濃縮至含生藥量5.63 g/mL。4℃保存，使用前加溫至37℃。阿霉素注射液（鹽酸多柔比星）規(guī)格：10mg/支（Pfizer Italia S.r.l.，批號(hào)2QL0036），購(gòu)于哈藥集團(tuán)醫(yī)藥有限公司。逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒：PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara，D6210A）。

1.3造模與分組實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)留取8只為正常組，其余40只大鼠制作阿霉素腎病模型：阿霉素注射液（鹽酸多柔比星）按2.75 mL/kg（5.5 mg/kg）和1.5 mL/kg（3 mg/kg）的劑量進(jìn)行2次尾靜脈注射，2次間隔時(shí)間為2周。造模結(jié)束，根據(jù)每只成模大鼠24 h尿蛋白定量隨機(jī)分組，各組分離飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分4組：正常組、模型組、防己黃芪湯高劑量治療組和防己黃芪湯低劑量治療組。

1.4給藥方法治療組劑量折算方法：低劑量組按臨床等效量折算（1 mL/100g），高劑量組為臨床等效量2倍（2mL/100g），模型組和正常組予等量蒸餾水灌胃。給藥時(shí)間均為連續(xù)5周。

1.5標(biāo)本采集及檢測(cè)大鼠分別置代謝籠24 h，收集全部尿液，測(cè)定尿蛋白量。每組隨機(jī)選取3只大鼠，脫頸椎處死后，取左側(cè)腎臟，液氮凍存。1）24 h尿蛋白定量［1］。采用磺柳酸-硫酸鈉法。2）腎組織HPA mRNA表達(dá)。采用RT-PCR法。提取各組樣本總RNA，采用核酸蛋白分析儀分別測(cè)定不同組樣品所提RNA濃度，分別取相同量RNA為模板（本實(shí)驗(yàn)所取RNA量為1 μg），對(duì)目的基因HPA和內(nèi)參基因β-actin行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μL行PCR擴(kuò)增。分別取相同體積的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6μL進(jìn)行電泳，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。HPA引物序列：上游5′-CAGCAGG ACACGTCATCATCA-3′，下游5′-TGCAGCCATCACAT GACCA-3′。β-actin引物序列：上游5′-CAACCGTGAAAAGATGACCCA-3′，下游5′-AATGCCAGTGGT ACGACCAGA-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組24 h尿蛋白定量比較見表1。與正常組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白定量明顯升高（P＜0.05），說明造模成功；與模型組比較，防己黃芪湯高、低劑量組大鼠尿24 h蛋白量則明顯減少（P＜0.05）。

表1　各組大鼠24 h尿蛋白定量比較（mg，±s）

表1　各組大鼠24 h尿蛋白定量比較（mg，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n 24 h尿蛋白定量正常組　3模型組　3防己黃芪湯低劑量組　3 23.77±1.63△76.73±39.87 27.31±18.48△防己黃芪湯高劑量組　347.35±22.63△

2.2腎組織HPA mRNA表達(dá)見圖1，表2。與正常組比較，模型大鼠HPA mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。防己黃芪湯高、低劑量治療組與模型組比較HPA mRNA表達(dá)下降（P＜0.05），兩治療組組間差異不明顯。

3　討　論

防己黃芪湯是治療表虛水腫的代表方劑，臨床用于治療腎臟系統(tǒng)疾病較多。近年來已有該方減少蛋白尿的臨床和實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告，表明其在減少腎小球疾病患者蛋白尿，改善其臨床癥狀，從而延緩其腎功能下降方面有良好作用，所以有必要進(jìn)一步探討其作用機(jī)制［2-4］。

M，100bp marker（從下到上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp），1.正常組；2.防己黃芪湯低劑量組；3.防己黃芪湯高劑量組；4.模型組

表2　各組大鼠腎組織HPA mRNA表達(dá)（±s）

表2　各組大鼠腎組織HPA mRNA表達(dá)（±s）

組別　n　表達(dá)相對(duì)系數(shù)β-actin基因光密度　HPAmRNA光密度正常組　3　0.7996±0.063模型組　3　1.2816±0.171防己黃芪湯低劑量組　3　1.0968±0.054 2680560　2109560△3644208　4490304 2874444　3113806△防己黃芪湯高劑量組　3　0.8507±0.025 2408625　2117360△

蛋白尿是各種腎臟疾病共有的臨床表現(xiàn)，尿中蛋白質(zhì)的量和持續(xù)時(shí)間直接反映腎小球?yàn)V過功能和腎小管重吸收功能的好壞，所以蛋白尿成為評(píng)價(jià)治療腎臟疾病藥物療效的重要指標(biāo)，能有效降低24 h尿蛋白定量是大多數(shù)腎臟病治療的首要任務(wù)。本研究組已有研究結(jié)果表明，防己黃芪湯可以通過減少阿霉素腎病大鼠腎組織Podocin及Nephrin表達(dá)，保護(hù)模型大鼠腎小球?yàn)V過功能［5-6］。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，阿霉素造模后，大鼠尿蛋白量明顯增加，說明其腎小球?yàn)V過功能被嚴(yán)重破壞。治療組大鼠尿蛋白排出量減少，但組間比較并無明顯差異，未見明顯量效關(guān)系。

3.2防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織HPA基因表達(dá)的影響腎小球?yàn)V過屏障（GFB）包括電荷屏障和機(jī)械屏障，其各組分的損傷及其相互作用障礙，均參與蛋白尿的形成［7］。其中腎小球基底膜（GBM）主要承擔(dān)電荷屏障作用。GBM上有多種蛋白與腎小球?yàn)V過功能相關(guān)，硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）是其中之一，由此蛋白為主要成分所構(gòu)成的陰離子位點(diǎn)使腎小球?yàn)V過膜具備電荷屏障［8-10］。HSPG相連形成帶有多量負(fù)電荷的硫酸肝素（HS）多糖鏈，這決定了GBM的電荷選擇通透性［11-12］。因此，各種病因破壞濾過膜上的HS，破壞腎小球上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的錨連位點(diǎn)，會(huì)使濾過膜電荷選擇性降低，導(dǎo)致濾過屏障功能異常［13］。HPA是一種可特異性水解HS，降解HSPG上HS多糖鏈的內(nèi)切葡糖醛酸酶，HS水解后，腎小球的電荷屏障被破壞，導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)和增加［12-13］。相反，GBM上的HPA表達(dá)減少，濾過膜電荷選擇性得到保護(hù)，蛋白尿可相應(yīng)減少［14］。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，HPA在正常大鼠腎組織上僅有微量表達(dá)。模型大鼠表達(dá)則明顯增加。防己黃芪湯治療組大鼠腎組織HPA基因水平降低，表明該方可通過降低腎組織HPA基因表達(dá)對(duì)阿毒素腎病大鼠腎小球?yàn)V過膜的電荷屏障產(chǎn)生保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

［1］孫田美，梅長(zhǎng)林.腎臟疾病尿液檢查手冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：91-92.

［2］程保智，許筠，翟曉麗，等.防己黃芪湯合當(dāng)歸芍藥散治療慢性腎小球腎炎43例［J］.河南中醫(yī)，2011，31（4）：328-329.

［3］徐燕舞.防己黃芪湯治療原發(fā)性腎病綜合征的臨床療效研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（22）：286-288.

［4］王嵐，范堯夫，魏睦新.防己黃芪湯加味治療原發(fā)性腎病綜合征療效分析［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15（3）：111-112.

［5］王聞婧，陳春艷，符強(qiáng).防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠腎組織Podocin表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014，42（6）：57-59.

［6］陳春艷，王聞婧，紀(jì)寶華，等.防己黃芪湯對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿和腎組織Nephrin的作用［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2013，22（3）：361-364.

［7］Tryggvason K，Wartiovaara J.How does the kidney filter plasma［J］.Physiology（Bethesda），2005，20（2）：96-101.

［8］Katz A，Van-Dijk DJ，Aingom H，et al.Involvement of human heparanase in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Isr Med Assoc J，2002，4：996-1002.

［9］Maxhimer JB，Somenek M，Rao G，et al.Heparanase-1 gene expression and regulation by high glucose in renal epithelial cells：a potential role in the pathogenesis of proteinuris in diabetic patients［J］.Diabetes，2005，54：2172-2178.

［10］魯艷芳，袁軍，林麗，等.中西醫(yī)結(jié)合對(duì)腎病模型腎小球基底膜陰離子位點(diǎn)的影響［J］.中醫(yī)研究，2005，18（4）：11.

［11］Zhang D，Seno S，Aklta M，et al.Histochemical studies on the mechanism of macromolecule leakage across the glomerular capillary wall［J］.Histochemistry，1991，96：115-121.

［12］C.J.ILSE RAATS，JACOB VAN DEN BORN，JOH.M.BERDEN.Glomerular heparan sulfate alterations：Mechanisms and relevance for proteinuria［J］.Kidney Int，2000，57：385-400.

［13］Levidiotis V，F(xiàn)reeman C，Tikellis C，et al.Heparanase inhibition reduces Proteinuria in a model of accelerated anti -glomerular basement membrane antibody disease［J］.Ne Phrology（Carlton），2005，10（2）：167-173.

［14］Kramer A，van den Hoven M，Rops A，et al.Induction of glomerular heparanase expression in rats with adriamycin nephropathy is regulated by reactive oxygen species and the Renin-angiotensin system［J］.J Am Soc Nephrol，2006，17 （9）：2513-2520.

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）03-0387-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.03.004

*基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12541750）

通信作者△（電子郵箱：yangjian13r＠163.com）

收稿日期（2015-11-13）

Effects of Fangji Huangqi Decoction on the Expression of Heparanase Adriamycin Nephropathy

FU Qiang，HUANG Yaxian，WANG Wenjing.
Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin150040，China.

【Abs tract】Objective：To study the protection of Fangji Huangqi Decoction on the Adriamycin Induced Nephropathy（AIN）rats and explore its mechanism.Methods：Wistar rats were given intravenous injections of ADR via tail vein，establishing adriamycin-induced nephropathy rat model.The model rats were randomly divided into the model group and the treatment groups of high-dosage and low-dosage medicine，and were then administered intragastrically by medicine in corresponding dosage.In next 5 weeks，rats in each group were detected in 24 hours urinary protein.Renal tissues routine was fixed，and heparanases expression was detected with reverse transcription PCR.Result：Those indices in the modle group were higher obviously than those in the routine group including the 24 hours urinary protein and the renal tissue HPA.However，these indicators of the highdosage and low-dosage medicine group were improved signifcantly than the modle group（P＜0.05）.Conclusion：Fangji Huangqi Decoction can reduce the quantity of 24 hours urine protein of Adriamycin Induced Nephropathy rats，and protect the glomerular filtration barrier by moderating the expression of heparanases.

【Key words】Adriamycin nephropathy；Fangji Huangqi Decoction；Heparanase