肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子對(duì)肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門(mén)市第二醫(yī)院肝膽外科，福建廈門(mén)361021

肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子對(duì)肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門(mén)市第二醫(yī)院肝膽外科，福建廈門(mén)361021

目的 研究肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（heparin?binding epidermal growth factor?like growth factor，HB?EGF）對(duì)肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響。方法 選擇60只SD雄性大鼠并建立肝移植動(dòng)物模型，隨機(jī)分為A、B、C三組，B組皮下注入0.1 mg／kg肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，C組皮下注射0.1 mg／kg HB?EGF，A組給予相等劑量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，比較三組肝臟濕重、肝功能、炎性因子含量。結(jié)果 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠移植肝臟的濕重均明顯高于A組（P＜0.05），血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）含量均明顯低于A組（P＜0.05）；干預(yù)后第3、5、7天時(shí)，B組、C組血清白蛋白（ALB）含量明顯高于A組（P＜0.05）；干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠肝臟組織中腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（IL?6）含量均明顯低于A組（P＜0.05）；C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量明顯低于B組（P＜0.05）。結(jié)論 HB?EGF能促進(jìn)肝移植模型大鼠肝細(xì)胞再生，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝功能、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

肝移植；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子；細(xì)胞再生；炎癥因子

活體肝移植是目前臨床上治療終末期肝臟疾病的主要方式，但受到移植后免疫排異反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等因素的影響，移植后肝臟的存活率并不理想，肝臟損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也較高［1］。近年來(lái)關(guān)于肝移植的研究中，供體肝臟與受體間比例不匹配是造成肝移植術(shù)后肝功能損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，供體肝臟的體積越小、移植后的損傷程度越重［2］。因此，移植后早期需要促進(jìn)肝臟迅速再生以降低供體肝臟與受體間不匹配的程度［3］。肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子（heparin binding epidermal growth factor?like growth factor，HB?EGF）是EGF家族的重要成員，對(duì)成熟肝細(xì)胞的分裂及增殖具有促進(jìn)作用。本研究中，我們分析了HB?

EGF對(duì)肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）：肝樂(lè)寧注射液，長(zhǎng)春普華制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20054108；規(guī)格2 ml。HB?EGF：美國(guó)Barnstead公司；全自動(dòng)生化分析儀：日本O?lympus Au型；多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio?rad公司El312e Microplate；低溫高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司Allegra 64R型；及配套試劑購(gòu)買(mǎi)于Roche公司，Ki?67、TNF?α、IL?6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Ebio?science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：供體動(dòng)物和受體動(dòng)物均為雄性清潔級(jí)SPF大鼠，體質(zhì)量200～250 g，共60只，隨機(jī)分為A組（生理鹽水組）、B組（HGF組）、C組（HB?EGF組）各20只。三組大鼠均建立肝移植動(dòng)物模型，B組給予0.1 mg／kg皮下注入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（1次／d），C組皮下注射0.1 mg／kg HB?EGF（1次／d），A組給予相等劑量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 保留肝臟30%動(dòng)物模型建立：三組大鼠均按照改良的二袖套法建立原位部分肝移植模型，在供體大鼠上切取供體肝臟，切除肝左葉、右葉、兩片尾葉及肝中葉鐮狀韌帶左側(cè)的部分，保留肝臟占全肝重量的約30%；切除受體大鼠的肝臟，并將供體肝臟移植進(jìn)入受體大鼠體內(nèi)，縫合血管。

1.2.3 肝臟濕重：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，稱重后用生理鹽水清洗肝臟，經(jīng)液氮冷凍后放置在－80℃冰箱保存。

1.2.4 肝功能：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，自肝下腔靜脈取血5 ml，3 000 r／min離心10 min（離心半徑r＝3 cm），采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）含量。

1.2.5 炎性因子：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，取出肝臟組織，稱量適量組織并加入PBS研磨，將研磨液放置在4℃離心機(jī)中離心，棄去殘?jiān)⒈Ａ羯锨宀⒉捎妹嘎?lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x ±s表示，不同時(shí)間、多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟濕重 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠移植肝臟的濕重均顯著高于A組（P＜0.05），B、C兩組間移植肝臟的濕重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表1）。

表1 三組大鼠移植肝臟濕重的比較（x ±s，g）Tab 1 Comparison of wet weight of liver transplantation in rats among three groups（x ±s，g）

2.2 肝功能 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組與C組大鼠的血清ALT、TBIL含量均明顯低于A組（P＜0.05），移植后3 d、5 d、7 d時(shí)，B組、C組血清ALB含量明顯高于A組（P＜0.05）；B、C兩組不同時(shí)點(diǎn)ALT、ALB、TBIL含量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見(jiàn)表2）。

表2 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)ALT、ALB、TBIL含量比較（x±s）Tab 2 Comparison of ALT，ALB and TBIL in rats among three groups in different time（x±s）

2.3 肝臟組織中炎癥因子含量 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量均明顯低于A組（P＜0.05），C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量明顯低于B組（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

表3 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝臟組織中TNF?α、IL?6含量比較（x ±s，ng／ml）Tab 3 Comparison of TNF?α and IL?6 in rats among three groups in different time（x ±s，ng／ml）

3 討論

供體肝臟與受體比例不匹配是造成肝移植后肝功能損傷、移植物不存活的重要原因。有研究［4］證實(shí)，肝移植物損傷的程度與自身體積及重量具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，即移植肝臟的重量越大、移植后損傷程度越輕。此外，肝臟移植后受到免疫排異反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等因素的影響會(huì)出現(xiàn)再生能力受損，細(xì)胞再生不足也會(huì)造成移植物功能損傷。因此，促進(jìn)肝移植后肝臟的快速再生能夠減輕肝功能損傷［5］。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF在肝再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，肝切除后輸入外源性HGF，可加速肝修復(fù)［6］。HB?EGF是EGF家族中的新成員，對(duì)成熟肝細(xì)胞的分裂過(guò)程具有促進(jìn)作用，在肝細(xì)胞的再生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。本研究中，干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B、C兩組大鼠移植肝臟的濕重顯著高于A組，說(shuō)明HGF、HB?EGF能夠促進(jìn)移植肝臟組織的生長(zhǎng)、增加移植肝臟組織的重量。

肝臟移植后，肝細(xì)胞的再生能夠保護(hù)移植物、減輕組織損傷［8］。ALT是位于肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶，肝細(xì)胞的損傷和破裂會(huì)造成ALT大量釋放進(jìn)入血液循環(huán)；ALB水平反映肝臟合成功能，當(dāng)肝臟病變達(dá)到一定程度時(shí)，ALB會(huì)呈一定程度的下降；TBIL大部分來(lái)自衰老紅細(xì)胞裂解釋放的血紅蛋白，其水平異常升高多提示肝功能受損［9?10］。本研究中，B、C兩組血清ALT、TBIL含量均明顯低于A組，ALB含量明顯高于A組，國(guó)內(nèi)學(xué)者高銀杰等［11］也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道，提示外源性細(xì)胞生長(zhǎng)因子、HB?EGF均能減輕移植組織肝細(xì)胞的損傷。

肝移植后造成供體肝臟損傷、影響細(xì)胞再生的主要途徑包括缺血再灌注損傷、免疫排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等［12］，而局部組織中炎癥因子的大量合成和釋放是多種途徑的共同作用方式，TNF?α、IL?6是兩類重要的炎癥因子［13］。TNF?α來(lái)自激活的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大［14］；IL?6由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌，具有多種生物學(xué)功能，是急性反應(yīng)過(guò)程中最敏感的介質(zhì)。本研究中，C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量均明顯高于A組、B組，說(shuō)明HB?EGF能夠抑制移植肝臟中炎癥因子的生成，有助于減輕局部組織中的炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，HB?EGF能夠促進(jìn)肝移植模型大鼠肝臟組織再生，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝功能、減輕炎癥反應(yīng)等有關(guān)。需要指出的是，本文觀察指標(biāo)相對(duì)較少，未對(duì)肝再生率進(jìn)行比較研究，且缺乏對(duì)可能作用機(jī)制的深入分析，有待于今后展開(kāi)更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去證實(shí)。

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（責(zé)任編輯：王全楚）

Effect of heparin binding epidermal growth factor?like growth factor on hepatic in?flammatory cytokines and cell regeneration in rat liver transplantation model

ZHOU Lixin，SU Jiqin，WANG Maolin，YAN Huidi，LIN Peiyi
Department of Hepatobiliary Surgery，the Second Hospital of Xiamen，Xiamen 361021，China

Objective To study the effect of heparin binding epidermal growth factor?like growth factor（HB?EGF）on hepatic inflammatory cytokines and cell regeneration in rat liver transplantation model.Methods Sixty male SD rats were established animal model of liver transplantation，and randomly divided into group A，group B，group C.Group B subcutaneous injection 0.1 mg／kg hepatocyte growth factor，group C subcutaneous injection 0.1 mg／kg HB?EGF，group A was given equal dose of normal saline to intervene.On the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，liver wet weight，liver function，liver inflammatory cytokines levels were compared among three groups.Results On the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，rats liver wet weight in group B，group C were significantly higher than those in group A（P＜0.05）.Serum ALT，TBIL were significantly lower than those in group A（P＜0.05）；on the 3rd，5th，7th day after inter?vention，serum ALB in group B，group C was significantly higher than that in group A（P＜0.05）；on the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，liver tissue TNF?α，IL?6 in group B，group C were signficantly lower than those in group A（P＜0.05）；liver tissue TNF?α，IL?6 in group C were signficantly lower than those in group B（P＜0.05）.Conclusion HB?EGF can promote liver transplantation model of rat liver cell regeneration，the mechanism may be related to the pro?tection of liver function，and the reduction inflammation reactions.

Liver transplantation；Hepatocyte growth factor；Heparin binding epidermal growth factor?like growth factor；Cell regeneration；Inflammatory factors

R575

A

1006－5709（2016）12－1463－04

2016?02?21

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.047

廈門(mén)市科技計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（3502Z20139012）

周立新，博士，主任醫(yī)師，碩士導(dǎo)師，研究方向：肝膽外科臨床及基礎(chǔ)研究。E?mail：zhoulix318＠163.com