利用多重?zé)晒舛縋CR協(xié)助診斷Crigler?Najjar綜合征Ⅱ型及Gilbert綜合征

劉 凡，車 芳，駱子義

1.深圳市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科，廣東深圳518000；2.廣東醫(yī)學(xué)院

利用多重?zé)晒舛縋CR協(xié)助診斷Crigler?Najjar綜合征Ⅱ型及Gilbert綜合征

劉 凡1，車 芳2，駱子義1

1.深圳市第三人民醫(yī)院內(nèi)一科，廣東深圳518000；2.廣東醫(yī)學(xué)院

目的 嘗試建立一個(gè)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系對Crigler?Najjar綜合征Ⅱ型（Crigler?Najjar syndromeⅡ，CNSⅡ）及Gil?bert綜合征（Gilbert syndrome，GS）患者的尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）基因突變進(jìn)行檢測，以運(yùn)用于協(xié)助以上疾病的臨床診斷。方法 選取國內(nèi)外目前報(bào)道較多UGT1A1基因常見突變的4個(gè)位點(diǎn)［A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp］，利用多重?zé)晒舛縋CR Tapman探針法對96例臨床診斷為GS或CNSⅡ患者及100名健康體檢者全血基因組進(jìn)行檢測，利用T?A克隆法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。結(jié)果 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系可有效檢測出實(shí)驗(yàn)樣本中所存在的以上4種基因突變。A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp在試驗(yàn)組測得的陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PCR產(chǎn)物電泳及測序結(jié)果與其基因檢測表型完全一致。結(jié)論 利用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)可以更簡便、快捷、有效地對GS或CNSⅡ患者中的UGT1A1基因突變進(jìn)行檢測，為臨床診斷提供有用信息。

多重?zé)晒釶CR；Crigler?Najjar綜合征Ⅱ型；Gilbert綜合征；UGT1A1

Crigler?Najjar綜合征（Crigler?Najjar syndrome，CNS）及Gilbert綜合征（Gilbert syndrome，GS）均屬于先天性非溶血性黃疸，是常染色體隱性遺傳疾?。?］。其中CNS好發(fā)于嬰幼兒，分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型（完全型）：患兒出生后迅速出現(xiàn)黃疸，多在出生后1～4 d即有顯著黃疸，膽紅素濃度可高達(dá)289～816 μmol／L，2周內(nèi)可出現(xiàn)肌肉痙攣和強(qiáng)直、驚厥、角弓反張等膽紅素腦病表現(xiàn)；Ⅱ型（部分型）：患兒出生后不久出現(xiàn)黃疸，病情較Ⅰ型相對較輕，無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，智力發(fā)育亦正常，也有在青少年或成年期發(fā)病。GS癥狀主要表現(xiàn)為反復(fù)間歇性未結(jié)合型膽紅素升高，常見于青少年發(fā)病。目前國內(nèi)外研究［2?3］顯示，CNSⅠ型和Ⅱ型及GS的本質(zhì)是負(fù)責(zé)非結(jié)合膽紅素代謝的關(guān)鍵酶－尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate glucuronosyl?transferase，UGT）的相關(guān)基因UGT1A1發(fā)生突變。目前國內(nèi)GS及CNS在臨床診斷方面仍主要靠臨床表現(xiàn)加以推斷，尚無較可靠的實(shí)驗(yàn)室檢查加以論證。本實(shí)驗(yàn)嘗試建立一個(gè)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系對GS及CNS患者的UGT1A1基因突變進(jìn)行檢測，以用于協(xié)助以上疾病的臨床診斷，并通過DNA測序，對該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取深圳市第三人民醫(yī)院2015年1月－2016年3月臨床診斷為GS或CNSⅡ患者作為試驗(yàn)組，年齡8～42歲，平均年齡（28±4）歲；選取已排除病毒性肝炎感染者及中毒性肝炎，且血清總膽紅素水平于3.4～17.1 μmol／L的健康體檢者作為對照組，入選者年齡14～58歲，平均年齡（37±5）歲。其中試驗(yàn)組96例，對照組100例，向所有入選者說明情況，經(jīng)其同意后抽取靜脈血標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 ABI7500 FAST實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、高速離心機(jī)（上?；?/p>

機(jī)械廠）、瓊脂糖凝膠電泳儀（上海艾測電子科技有限公）瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國ZYMO RESEARCH生物科技公司）、T?載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、超級感受態(tài)制備試劑盒、大腸桿菌DH5α、引物及Tapman探針（上海生工生物有限公司）、AxyPrep質(zhì)?；蚪MDNA小量制備試劑盒（康寧生命科學(xué)有限公司）、DNA提取試劑盒（艾德萊公司）、rTaq酶、dNTP、10×buffer、MgCl2等（大連寶生物公司）。

1.3 基因組DNA的抽提 抽取外周靜脈血3 ml，用EDTA抗凝，按照艾德萊公司DNA提取試劑盒說明書提取。

1.4 引物與Tapman探針的設(shè)計(jì) UGT1A1基因根據(jù)NCBI網(wǎng)站上（GenBank NM＿000463.2）基因序列及啟動(dòng)子序列（GenBank AY533181.1），用ABI Primer Express 2軟件對A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp這4個(gè)常見突變位點(diǎn)進(jìn)行引物和Taqman探針的設(shè)計(jì)見表1。

表1 探針和引物序列Tab 1 Probe and primer sequences

1.5 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系（1）：體積30 μl，高壓滅菌水17 μl、10×buffer 2.5 μl、25 mmol／L，MgCl23 μl、2.5 mmol／L，dNTP 2 μl、Gly71Arg和Pro229Gln，10 μmol／μl，上、下游引物各0.8 μl，10 μmol／μl野生、突變型探針各0.5 μl、rTaq酶0.3 μl，將PCR液振蕩混勻加入96孔板中，加入DNA模板2 μl，PCR條件為：94℃5min；94℃15 s，60℃75 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系（2）：體積30 μl，高壓滅菌水17.5 μl、10×buffer 2.5 μl、25 mmol／L，MgCl22.5 μl、2.5 mmol／L，dNTP 2 μl、A（TA）7TAA和Try486Asp 10 μmol／μl，上、下游引物各0.8 μl，10 μmol／μl野生、突變型探針各0.5 μl、rTaq酶0.3 μl，將PCR液振蕩混勻加入96孔板中，加入DNA模板2 μl。PCR條件為：94℃5 min；94℃15 s，63℃30 s，70℃45 s，40個(gè)循環(huán)。每組PCR反應(yīng)均設(shè)立陰性對照和陽性對照。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳及T?A克隆測序 將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上行電泳分離，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，用載體連接試劑盒和感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒連接PCR產(chǎn)物到pUCm?T載體及轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α上，用藍(lán)白斑篩選法挑取多個(gè)克隆菌落行PCR鑒定及搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌液，用AxyPrep質(zhì)粒基因組DNA小量制備試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，送華大基因廣州分公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 多重?zé)晒釶CR檢測結(jié)果 本多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系可有效檢測出試驗(yàn)樣本中所存在的以下4種基因突變（見圖1）：A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln及Try486Asp基因型，在試驗(yàn)組及對照組分布情況如表2所示。在以上四個(gè)位點(diǎn)中，采用SPSS 19.0軟件經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，A（TA）7TAA、Gly71Arg、Pro229Gln和Try486Asp四組各自突變總例數(shù)（純合子突變＋雜合子突變）的P值均＜0.05，提示在本試驗(yàn)體系中，實(shí)驗(yàn)組測得的陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 T?A測序結(jié)果 挑取一定數(shù)量的樣本進(jìn)行T?A克隆并測序，并對檢測結(jié)果和表型、電泳、測序結(jié)果進(jìn)行比較以達(dá)到100%的一致性。

圖1 4種突變的多重?zé)晒釶CR檢測結(jié)果 A：A（TA）7TAA；B：Gly71Arg；C：Try486Asp；D：Pro229GlnFig 1 Detection results of multiple fluorescence PCR with 4 kinds of mutations A：A（TA）7TAA；B：Gly71Arg；C：Try486Asp；D：Pro229Gln

表2 4種突變的出現(xiàn)情況Tab 2 The occurrence of 4 kinds of mutations

3 討論

隨著對GS及CNSⅠ、CNSⅡ發(fā)病機(jī)制的不斷研究，發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)UGT的活性差異在GS及CNS發(fā)病中有重要作用［4］，而UGT基因序列UGT1家族中第一外顯子（UGT1A1）的多態(tài)性起決定性作用，據(jù)Canu等［5］報(bào)道，迄今為止，曾被報(bào)道過的UGT1A1突變有130種，其中91種（70%）表現(xiàn)為單核苷酸的替換突變（77種錯(cuò)義突變和14種無義突變），21種（16.1%）表現(xiàn)為單核苷酸的缺失，10種（7.7%）表現(xiàn)為單核苷酸的插入，其余8種（6.2%）突變出現(xiàn)在基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子中。研究［4?6］證實(shí)：任何一個(gè)位點(diǎn)雜合突變，都至少可使UGT1A1表達(dá)產(chǎn)物降低到正常人的60%～70%，這一水平尚可維持膽紅素在體內(nèi)正常代謝，但降低到正常的30%以下就會發(fā)病。1至2個(gè)突變位點(diǎn)累積效應(yīng)便可使該基因表達(dá)下降到正常的20%左右從而表現(xiàn)為黃疸［7］。

其中，GS的UGT1A1基因突變有兩種類型：（1）TATA盒TA插入型。Kakadol等［8］發(fā)現(xiàn)GS主要與UGT1A1基因啟動(dòng)子上游距啟動(dòng)子25～35個(gè)bp處的TATA盒有關(guān)，表現(xiàn)為TATA盒中有TA插入，從而使A（TA）6TAA成為A（TA）7TAA。由于有TA的插入，使TATA盒序列延長，導(dǎo)致其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力下降，使UGT1合成減少而使UGT活性下降，且每增加一個(gè)TA就使UGT活性下降30%［7］；（2）基因突變型。在GS中比較常見的外顯子突變位點(diǎn)有：UGT1A1?6（G71R）、UGT1A1?7（Y486D）、UGT1A1?27（P229Q）和UGT1A1?62（F83L）。在日本、中國和韓國GS患者中，Gly71Arg最為常見，但缺乏群體數(shù)據(jù)［9］。其他編碼區(qū)的突變?nèi)纾旱谝煌怙@子Pro229Gln、Arg209Trp，第四外顯子Pro364Leu、Arg367Gly，第五外顯子Try486Asp在亞洲也較常見。

研究［9?10］顯示：CNS?I的UGT1A1突變形式多表現(xiàn)為無義突變（或移碼突變）和錯(cuò)義突變，這兩種突變都可表現(xiàn)為純合型或復(fù)合雜合型。其核苷酸的插入、缺失和無義突變都可導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子、移碼突變和剪切位點(diǎn)的改變，從而使UGT的功能缺乏。CNS?Ⅱ則主要表現(xiàn)為純合型錯(cuò)義突變。Canu等［5］提出UGT1A1啟動(dòng)子的基因型和編碼區(qū)的突變都可決定CNS的表現(xiàn)型（Ⅰ或Ⅱ）。CNS?Ⅱ突變多發(fā)生在編碼區(qū)第外1、2、4、5外顯子上，以純合子突變?yōu)槎嘁?，常與UGT1A1?28位點(diǎn)一起發(fā)生復(fù)合型突變，Yamamoto等［10］報(bào)道提出不同類型的Gry71Arg與Tyr486Asp的突變及組成不同的組合，在個(gè)體中可表現(xiàn)出UGT的活性差異。Gry71Arg的雜合子、純合子突變、Tyr486Asp的純合子突變及Gry71Arg＋Tyr486Asp的雙純合子突變，其表現(xiàn)UGT的活性分別為正常人的（60.2± 3.5）%、（32.2±1.6）%、（7.6±0.5）%和（6.2±1.6）%。由此可見，GS及CNSⅠ、CNSⅡ這3種疾病在基因變異方面存在一定程度的共性，其中UGT1A1最終表達(dá)產(chǎn)物的水平高低將決定膽紅素代謝異常的嚴(yán)重程度。

如今多重?zé)晒釶CR技術(shù)已廣泛用于多種病原微生物同時(shí)檢測和鑒定，某些遺傳疾病及癌基因的分型鑒定，如乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和乳頭瘤病毒的分型，13?三體綜合征及18?三體綜合征的診斷運(yùn)用，為目前多種臨床疾病的診斷提供更經(jīng)濟(jì)、簡便及有效的診斷方法。反觀目前國內(nèi)臨床上對于GS及CNS的診斷，其中除去CNSⅠ患者由于多在出生后1個(gè)月內(nèi)死于核黃疸，而無后續(xù)診斷外，GS及CNSⅡ仍大多依靠排他法。雖然肝穿刺活檢術(shù)為其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種有創(chuàng)性的檢查在臨床上很難普遍實(shí)行。如今，只有少數(shù)大型的醫(yī)療機(jī)構(gòu)可用傳統(tǒng)的全基因組測序的方法，對GS及CNSⅡ在基因?qū)用嫔献龀鲈\斷。綜上所述，目前國內(nèi)需要相關(guān)的基因檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對其準(zhǔn)確、快捷的診斷，本實(shí)驗(yàn)建立的多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系可在一定程度上給予疑似患者相關(guān)基因檢測信息，對其最終臨床確診提供更多幫助。

［1］Bosma P，Chowdhary JR，Jansen PH.Genetic inheritance of Gilbert’s syndrome［J］.Lancet，1995，346（8970）：314?315.

［2］Wang J，F(xiàn)ang LJ，Li L，et al.A new frame?shifting mutation of UGT1A1 gene causes type I Crigler?Najjar syndrome［J］.Chin Med J（Engl），2011，124（23）：4109?4111.

［3］Kringen MK，Piehler AP，Grimholt RM，et al.Serum bilirubin con?centration in healthy adult North?Europeans is strictly controlled by the UGT1A1 TA?repeat variants［J］.PLoS One，2014，9（2）：1?8.

［4］Strassburg CP.Hyperbilirubinemia syndromes（Gilbert?Meulengracht，Crigler?Najjar，Dubin?Johnson，and Rotorsyndrome）［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2010，24（5）：555?571.

［5］Canu G，Minucci A，Zuppi C，et al.Gilbert and Crigler?Najjar syn?dromes：an update of the UDP?glucuronosyltransferase1A1（UGT1A1）gene mutation database［J］.Blood Cells Mol Dis，2013，50（4）：237?280.

［6］Burchell B，Soars M，Monaghan G，et al.Drug Mediated toxicity caused by genetic deficiency of UDP?glucuron osyltransferases［J］.Toxical Lett，2000，112?113：333?340.

［7］Rodrigues C，Vieira E，Santos R，et al.Impact of UGT1A1 gene vari?ants on total bilirubin levels in Gilbert syndrome patients and in healthy subjects［J］.Blood Cells MoI Dis，2012，48（3）：166?172.

［8］Kakadol A，Sappal BS，Ghosh SS，et al.Interaction of coding region mutations and the Gilbert?type promoter abnormality of the UGT1A1 gene causes moderate degrees of unconjugated hyperbilirubinemia and may lead to neo?natalkernicterus［J］.J Med Genet，2001，38（4）：244?249.

［9］Owens D，Evans J.Population studies on Glibert’s syndrome［J］.J Med Genet，1975，12（2）：152?156.

［10］Yamamoto K，Sato H，F(xiàn)ujiyama Y，et al.Contribution of two missense mutations（G71RandY486D）of the bilirubin UDP glycosyl transferase（UGT1A1）gene topheno types of Gilbert’s syndrome and Crigler?Najjar syndrome typeII［J］.Biochimicaet Biophysica Acta，1998，1406（3）：267?273.

（責(zé)任編輯：馬 軍）

Using multiple fluorescence PCR technique to assist in the diagnosis of Crigler?Najjar syndrome typeⅡand Gilbert syndrome

LIU Fan1，CHE Fang2，LUO Ziyi1
1.Department of Internal Medicine，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518000；2.Guangdong Medical College，China

Objective To establish a multiple fluorescence quantitative PCR reaction system for Crigler?Najjar syn?drome typeⅡ（CNSⅡ）and Gilbert syndrome（GS）in patients with uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1（UGT1A1）gene mutation testing，and apply to assist in the clinical diagnosis of the disease.Methods We selected 4 common mutation sites［A（TA）7TAA，Gly71Arg，Pro229Gln and Try486Asp］from UGT1A1 gene that currently repor?ted at home and abroad at present.Using multiple fluorescence PCR Tapman probe to detect the whole genome that 96 patients were clinical diagnosis of GS or CNSⅡand 100 healthy controls，using the method of T?A clone sequencing to test the PCR?amplified product.Results This multiple fluorescence quantitative PCR reaction system could effectively detect the test samples of the above 4 kinds of genetic mutations.The positive rate of A（TA）7TAA，Gly71Arg，Pro229Gln and Try486Asp measured in clinical group were higher than the control group，with statistical significance.PCR products electrophoresis and T?A clone sequencing were completely conform to the gene types（P＜0.05）.Conclu?sion Using multiple fluorescent quantitative PCR technology can be more convenient，fast and effectively to detect UGT1A1 gene mutations in patients of GS or CNSⅡ，provide information for clinical diagnosis.

Multiple fluorescence PCR；Crigler?Najjar syndrome typeⅡ；Gilbert syndrome；UGT1A1

R596

A

1006－5709（2016）12－1389－04

2016?09?01

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.022

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（醫(yī)療衛(wèi)生類）（201607026）

劉凡，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：先天性黃疸的基因檢測。E?mail：44065895＠qq.com