頸靜脈灌注精氨酸對泌乳中期奶牛血清生化和免疫指標(biāo)的影響

丁洛陽　梁祥煥　王夢芝**　張　軍,*

王洪榮1　周　剛1　張　鑫1　徐巧云1

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225009；2.揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場，揚州225009)

*同等貢獻作者

頸靜脈灌注精氨酸對泌乳中期奶牛血清生化和免疫指標(biāo)的影響

丁洛陽1梁祥煥2*王夢芝1**張軍1,2**

王洪榮1周剛1張鑫1徐巧云1

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州225009；2.揚州大學(xué)實驗農(nóng)牧場，揚州225009)

摘要：本文旨在研究頸靜脈灌注精氨酸對泌乳中期奶牛血清生化和免疫指標(biāo)的影響。采用3×3復(fù)式拉丁方試驗設(shè)計，選擇6頭體重、胎次、泌乳期、泌乳量和體況基本一致的荷斯坦奶牛為試驗動物，隨機分為3組(每組2頭)，分別為酪蛋白組(對照組)、精氨酸組(灌注37.66 g/d)、丙氨酸組(與精氨酸組等氮，灌注77.24 g/d)；每個試驗期為22 d(7 d灌注+15 d間隔)，在每個試驗灌注期的最后1 d晨飼前采血，測定血清生化和免疫指標(biāo)。結(jié)果表明：精氨酸組的奶牛血清中總蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度要顯著高于其他2組(P<0.05)，白球比、白細(xì)胞介素1(IL-1)濃度顯著高于丙氨酸組(P<0.05)，但是牛奶中體細(xì)胞數(shù)顯著低于其他2組(P<0.05)，而血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)、白細(xì)胞介素6(IL-6)濃度在組間無顯著差異(P>0.05)。綜上，灌注精氨酸能夠通過提高血清總蛋白、IgG及IL-1、TNF-α的濃度，從而一定程度上增強泌乳奶牛機體的免疫力和胎兒的被動免疫力。

關(guān)鍵詞：頸靜脈灌注；精氨酸；免疫球蛋白；細(xì)胞因子；體細(xì)胞數(shù)

隨著高密度集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，動物常處于免疫應(yīng)激狀態(tài)中，導(dǎo)致動物體需要消耗更多的營養(yǎng)成分以維持免疫反應(yīng)的需要[1]，從而導(dǎo)致動物對飼料利用效率降低，生長發(fā)育受到限制，引起生產(chǎn)性能的下降。而如何通過營養(yǎng)調(diào)控的方法來促進機體免疫力，進而提高生產(chǎn)性能已成為當(dāng)前主要的研究課題[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)某些氨基酸除了為構(gòu)成機體最基本物質(zhì)(蛋白質(zhì))合成提供底物外，還能夠通過自身及其代謝產(chǎn)物對機體內(nèi)的許多代謝反應(yīng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，精氨酸(arginine，Arg)作為機體的一種條件性必需氨基酸和功能性氨基酸[3-4]，已受到越來越多的關(guān)注。劉鳳菊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以平均日增重為評價指標(biāo)時，1～3周齡雌性肉仔雞的精氨酸需要量為1.38%。Zhou等[6]在黃石斑魚的研究中發(fā)現(xiàn)，黃石斑魚幼魚對飼料中精氨酸需要量為2.8%。曾雯娉[7]研究報道，凡納濱對蝦幼蝦對飼糧中精氨酸需要量為2.16%，而對于泌乳奶牛中精氨酸需要量尚未見明確的文獻報道。而在應(yīng)激、創(chuàng)傷或饑餓狀態(tài)下，機體對精氨酸的需求大大增加，僅靠自身合成不能滿足生理代謝的需求，必須及時補充。而且，精氨酸能夠顯著增加胸腺的重量并提高胸腺淋巴細(xì)胞數(shù)，可以緩解由于機體損傷所引起的胸腺萎縮[8]。Jahanian[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過向肉雞飼糧中添加高于NRC推薦量的精氨酸能夠增強機體的免疫功能；還可通過提高家禽體內(nèi)免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)以及CD4+細(xì)胞的濃度來提高對敗血癥的抵抗力[10]。此外，精氨酸還能有效地減輕或者消除機體在熱應(yīng)激情況下產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[11-13]，進而提高生產(chǎn)性能。在奶牛上的研究已經(jīng)表明，提供2倍需要量的精氨酸能夠提高乳腺上皮細(xì)胞分泌牛奶酪蛋白的含量[14]，但是，關(guān)于精氨酸對奶牛免疫性能的作用尚無直接研究報道。本課題組前期體外奶牛乳腺上皮細(xì)胞的研究表明，提供2倍需要量的精氨酸可獲得最高的酪蛋白表達(dá)量。為此，本試驗在灌注精氨酸研究其調(diào)控奶牛泌乳性能的基礎(chǔ)上，通過測定奶牛血清免疫抗體、細(xì)胞因子等指標(biāo)，來初步研究闡明精氨酸對泌乳中期奶牛機體免疫力的影響，以期為精氨酸在奶牛上的生產(chǎn)應(yīng)用研究提供一些基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1試驗動物與試驗設(shè)計

將試驗牛隨機分為3組，試驗采用3×3復(fù)式拉丁方設(shè)計，每期22 d(包括灌注期7 d，間隔期15 d)。3組試驗用灌注液分別為：酪蛋白組(對照組)、以對照組為基礎(chǔ)的精氨酸組(本試驗選擇體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗促進酪蛋白表達(dá)最優(yōu)的2倍精氨酸濃度進行灌注，灌注量為37.66 g/d)[14]、丙氨酸組(與2倍精氨酸組等氮，灌注量為77.24 g/d)。灌注液由南京劍橋生物科技有限公司配制，每組每天經(jīng)由頸靜脈滯留針勻速灌注8 h，灌注總量皆為4 L。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided following per kg of diet:CuSO425 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 75 mg，ZnSO4·H2O 105 mg，Co 0.002 4 mg，Na2SeO30.016 mg，VA 12 000 IU，VD310 000 IU，VE 25 mg，煙酸 nicotinic acid 36 mg，膽堿 choline 1 000 mg。

2)飼糧泌乳凈能依據(jù)各原料泌乳凈能和飼糧中原料比例的計算，其他營養(yǎng)水平為實測值。NELin diet was calculated according to NELof ingredients and their percentages in diet, and the other nutrient levels were measured values.

1.2樣品采集

每個試驗期結(jié)束時，每頭試驗牛頸靜脈采血，1份加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·Na2)抗凝管中，用于血常規(guī)分析；1份加入促凝管中，447.2×g離心20 min并取血清，用于免疫球蛋白等生化指標(biāo)測定。

1.3血清IgA、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)濃度測定

采用北京華英生物技術(shù)研究所的牛IgA、IgG、IgE檢測試劑盒(BS-0360)，測定血清中IgA、IgG及IgE濃度，具體測定步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4血清免疫細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度測定

IL-1、IL-6及TNF-α濃度采用放射免疫法測定，所使用的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒均購自上海R&B公司(CK-E94174B、CK-E92031B、CK-E92026B)，具體測定步驟參照試劑盒說明書進行。

1.5血常規(guī)及血清生化指標(biāo)測定

總蛋白濃度、白球比、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性在揚州市疾病控制中心測定。

1.6統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2003整理統(tǒng)計后，利用SAS 9.0軟件中的方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗和多重比較。P<0.05為顯著差異水平。

2結(jié)果與分析

2.1血清免疫球蛋白濃度和牛奶體細(xì)胞數(shù)

由表2可知，各組間血清中IgA與IgE濃度無顯著差異(P>0.05)，而IgG濃度以精氨酸組最高，丙氨酸組次之，酪蛋白組最低，組間差異顯著(P<0.05)。此外頸靜脈灌注精氨酸能夠顯著降低牛奶中體細(xì)胞數(shù)，精氨酸組奶牛牛奶中的體細(xì)胞數(shù)顯著低于酪蛋白組及丙氨酸組(P<0.05)，酪蛋白組與丙氨酸組間無顯著差異(P>0.05)。

表2　精氨酸灌注對泌乳奶牛血清免疫球蛋白濃度和牛奶體細(xì)胞數(shù)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2血清生化指標(biāo)

由表3可知，頸靜脈灌注精氨酸能夠顯著提高泌乳奶牛血漿中總蛋白的濃度及白球比(P<0.05)，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性沒有顯著的變化(P>0.05)。

表3　精氨酸灌注對泌乳奶牛血清生化指標(biāo)的影響

2.3免疫細(xì)胞因子

由表4可知，泌乳牛血清中IL-6濃度不受灌注精氨酸的影響，各組間IL-6濃度沒有顯著差異(P>0.05)；而精氨酸組血清中IL-1濃度最高，要顯著高于酪蛋白組(P<0.05)，但是與丙氨酸組之間差異不顯著(P>0.05)。TNF-α濃度以精氨酸組最高，顯著高于其他2組(P<0.05)，這2組之間無顯著差異(P>0.05)。

3討論

3.1精氨酸灌注對泌乳奶牛血清免疫球蛋白濃度和牛奶體細(xì)胞數(shù)的影響

精氨酸在體內(nèi)除了作為多種化合物底物參與機體組織代謝與蛋白質(zhì)代謝外，還可作為一種游離型的氨基酸間接參與細(xì)胞增殖，神經(jīng)傳遞及免疫應(yīng)答等活動。研究表明，精氨酸在精氨酸酶的作用下分解產(chǎn)生鳥氨酸，其進一步分解生成的多胺對細(xì)胞增殖、創(chuàng)面愈合有重要作用[15]；在一氧化氮合成酶的作用下生成的一氧化氮能夠滅殺病毒、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞等[16-17]。因此，精氨酸與機體免疫功能等密切相關(guān)[18-20]。免疫球蛋白能夠與抗原結(jié)合，激活機體自身的免疫反應(yīng)，還能夠刺激抗體生成，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[21]。其中，IgG在血清中的濃度最高，具有調(diào)理吞噬、結(jié)合細(xì)菌等顆?？乖让庖咦饔肹22]，而且是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白，在自然被動免疫中起重要作用[23]。IgA和IgE能夠耐受蛋白酶的消化作用，是機體消化道和呼吸道免疫的主要抗體[24]。

表4　精氨酸灌注對泌乳奶牛血清免疫細(xì)胞因子濃度的影響

精氨酸能夠通過提高胃癌患者血清中IgA、IgM以及CD4+的濃度提高病患對胃癌的抵抗力[10,25]；還能夠顯著提高大鼠腸道中淋巴結(jié)數(shù)量和IgA的濃度，并顯著提高試驗大鼠的存活率[26]。飼糧中添加0.3%和0.6%的精氨酸能夠顯著提高艾美耳球蟲攻毒后肉仔雞血清中IgM和IgG濃度，改善肉雞的體液免疫水平[27]。Tan等[28]在肉雞中通過強飼球蟲疫苗誘發(fā)空腸炎癥反應(yīng)，在補給精氨酸后發(fā)現(xiàn)腸黏膜中IgA和IgG的濃度有顯著的提高。在泌乳母豬的研究中也發(fā)現(xiàn)，精氨酸組母豬血清中IgG、IgM的濃度要顯著高于對照組[29]。本試驗在奶牛的研究上發(fā)現(xiàn)，精氨酸可顯著提高泌乳奶牛血清中IgG濃度，而對IgA、IgE濃度卻沒有顯著影響。與上述其他畜禽添加效果并不完全一致，可能是由于物種不同所致，但也提示精氨酸可通過提高血清IgG進而提高奶牛機體本身的免疫力和胎兒的被動免疫力。

牛奶體細(xì)胞數(shù)是指每毫升牛奶中的細(xì)胞數(shù)，多數(shù)是白細(xì)胞，通常由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多形核嗜中性白細(xì)胞和少量乳腺組織上皮細(xì)胞等組成，約占牛體細(xì)胞數(shù)的95%，其余是乳腺組織死去脫落的上皮細(xì)胞[30]。牛奶中體細(xì)胞數(shù)是評價奶牛乳房健康狀況和牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)，當(dāng)奶牛泌乳系統(tǒng)受到細(xì)菌侵襲而發(fā)生感染和損傷時，承擔(dān)機體損傷修復(fù)以及排除感染功能的白細(xì)胞就會在乳腺中大量集聚，進而促使牛奶中體細(xì)胞數(shù)大幅上升[31]。前人研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中補充精氨酸能夠顯著提高母豬的泌乳性能[32]，而本試驗研究發(fā)現(xiàn)灌注精氨酸能夠顯著降低泌乳奶牛牛奶中體細(xì)胞數(shù)。

3.2精氨酸灌注對泌乳奶牛血清生化指標(biāo)的影響

血清總蛋白主要在肝臟中合成，由血清白蛋白和血清球蛋白組成，血清總蛋白在體內(nèi)除了作為機體的主要營養(yǎng)源，還參與維持體內(nèi)的滲透壓，作為機體蛋白質(zhì)的重要來源用于組織修補，其濃度的高低直接反映出動物生長發(fā)育情況和生理健康狀態(tài)。本試驗在奶牛上的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精氨酸顯著提高了血清中總蛋白濃度，作為機體免疫球蛋白的合成原料，血清蛋白質(zhì)濃度的升高，不僅反映了泌乳奶牛對飼糧蛋白質(zhì)利用率的改善，而且還改善了機體的體液免疫水平。李新國[33]在7日齡斷奶仔豬飼糧中添加0.6%和0.8%精氨酸的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸能顯著提高仔豬血清中總蛋白濃度，廖英杰等[34]在團頭魴幼魚飼糧補充精氨酸發(fā)現(xiàn)，血清總蛋白濃度隨著飼糧精氨酸水平升高而顯著升高，Zhou等[35]在南美白對蝦的研究中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律。白球比作為臨床醫(yī)學(xué)上肝功能檢測的一個重要指標(biāo)，其數(shù)值的高低能夠一定程度地反映機體的免疫狀況，本試驗中向機體補充精氨酸顯著提高了總蛋白中白球比，進而可提高泌乳奶牛的機體健康狀態(tài)。劉玉蘭等[36]通過向仔豬飼糧中添加精氨酸的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸能夠在一定程度上緩解脂多糖刺激所導(dǎo)致的總蛋白、白蛋白濃度的降低，提高白球比。楊慧等[29]也發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠顯著提高母豬血清中白球比，并通過促進機體蛋白質(zhì)的合成來維持機體血液中抗體的合成和分泌，從而提高機體的免疫力[37]。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶是廣泛存在于動物細(xì)胞線粒體中的2種氨基轉(zhuǎn)移酶，在機體蛋白合成與氨基酸代謝起著重要作用，它們的活性與氨基酸代謝強弱有一定關(guān)聯(lián)[38]。本試驗中灌注精氨酸并沒有對ALT及AST的活性產(chǎn)生影響。這一結(jié)果與潘杰等[39]在斷奶仔豬上的研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。

3.3精氨酸灌注對泌乳奶牛血清中細(xì)胞因子濃度的影響

細(xì)胞因子IL-1和IL-6作為一種淋巴細(xì)胞刺激因子，可以促進B細(xì)胞增殖和抗體分泌[40-41]。TNF-α對腫瘤細(xì)胞具有直接的抑制增殖和壞死作用，但對正常細(xì)胞的生長分化及其代謝功能的發(fā)揮無影響。此外，TNF-α還可通過活化巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)的產(chǎn)生來介導(dǎo)免疫應(yīng)答[42-43]。本試驗結(jié)果表明，精氨酸能夠提高泌乳奶牛血清中免疫細(xì)胞因子IL-1和TNF-α的濃度，這一結(jié)果與郭祎瑋[44]在肉仔雞中所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，該試驗通過向飼糧中添加不同水平的精氨酸發(fā)現(xiàn)，肉仔雞血清中IL-1和TNF-α濃度隨飼糧中精氨酸添加量的上升呈二次上升趨勢，李新國[33]在斷奶仔豬中的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.8%精氨酸能夠顯著提高仔豬脾臟中TNF-α的基因表達(dá)量。這些結(jié)果均表明，精氨酸能夠在一定程度上提高IL-1和TNF-α的濃度，通過促進炎癥反應(yīng)而有利于吞噬細(xì)胞清除侵入機體的病原體，進而提高泌乳奶牛機體的自我防御能力。

另有研究報道，給肌注脂多糖(LPS)引發(fā)全身炎癥反應(yīng)的肉雞補給精氨酸，可緩解IL-1和IL-6的過量表達(dá)，并減輕由于LPS引起的炎癥反應(yīng)[45]；給注射LPS引發(fā)炎癥反應(yīng)的斷奶仔豬飼糧中補充精氨酸，可抑制LPS引起腸道中IL-6和TNF-α的過量表達(dá)，進而緩解了機體的炎癥反應(yīng)[46]；向熱應(yīng)激小鼠飼糧中添加精氨酸，有利于改善由于熱應(yīng)激引起的IL-1、干擾素γ(INF-γ)、TNF-α等mRNA的過量表達(dá)，從而緩解機體的熱應(yīng)激并降低小鼠死亡率[47]。以上研究表明，補給精氨酸還能緩解免疫應(yīng)激或熱應(yīng)激狀態(tài)下機體的炎癥反應(yīng)和應(yīng)激狀態(tài)，這在今后精氨酸在奶牛的應(yīng)用研究中還需要進一步的開展試驗予以闡明。

4結(jié)論

綜上，頸靜脈灌注精氨酸提高了奶牛血清中白球比及總蛋白、IgG及IL-1和TNF-α的濃度，且能夠降低牛奶中體細(xì)胞數(shù)，有利于提高奶牛機體的免疫能力和胎兒被動的免疫力。

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*Contributed equally

**Corresponding authors: WANG Mengzhi, associate professor, E-mail: mengzhiwangyz@126.com; ZHANG Jun, associate professor, E-mail: yzu7788@163.com

(責(zé)任編輯王智航)

Effects of Arginine Infusion through Jugular Vein on Serum Biochemical and Immune Indices of Dairy Cows at Mid-Lactation

DING Luoyang1LIANG Xianghuan2*WANG Mengzhi1**ZHANG Jun1,2**WANG Hongrong1ZHOU Gang1ZHANG Xin1XU Qiaoyun1

(1. College of Animal and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Experimental Farm of Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract:This study was conducted to investigate the effects of arginine infusion through jugular vein on serum biochemical and immune indices of dairy cows at mid-lactation. A 3×3 Latin square trail was used. Six healthy lactating cows at similar lactation stages with similar body weight, parities, days in milk, milk yield and body condition were selected and divided into 3 groups (2 for each group), which were casein group (control group), arginine group (infused 37.66 g/d), and alanine group (equal nitrogen to arginine group, infused 77.24 g/d); three periods of test were carried out, and each period lasted for 22 d (7-day infusion period plus 15-day interval period). Blood was collected before morning feeding at the last day of infusion period to detect serum biochemical and immune indices. The results showed as follows: the concentrations of total protein, immunoglobulin G (IgG), tumor necrosis factor α (TNF-α) in serum in arginine group were significantly higher than those in other groups (P<0.05), the concentrations of interleukin 1 (IL-1) and the ratio of albumin to globulin in arginine group were significantly higher than those in alanine group (P<0.05), and the number of somatic cells in milk in arginine group was significantly lower than that in other 2 groups (P<0.05), but no significant differences were found in the activities of gluamic-pyruvic transaminase and glutamic oxalacetic transaminase, and the concentrations of immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE) and interleukin 6 (IL-6) among groups (P>0.05). In conclusion, arginine infusion can promote immunity performance of lactating cows and the passive immunity of fetus in some degree by increasing serum total protein, IgG, IL-1 and TNF-α concentrations.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(6)：1899-1906]

Key words:jugular vein infusion; arginine; immune globulin; cytokine; somatic cells

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.033

收稿日期：2015-12-30

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金基礎(chǔ)研究項目(BK20141270，BK20151312)；江蘇省高校研究生創(chuàng)新工程項目(KYLX14_1358)；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科(PAPD)

作者簡介：丁洛陽(1991—)，男，江蘇常州人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: 15252571328@163.com **通信作者：王夢芝，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: mengzhiwangyz@126.com；張軍，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: yzu7788@163.com

中圖分類號：S823

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)06-1899-08