飼糧陰陽離子差水平對小鼠血鈣濃度及胃腸道組織鈣結合蛋白-D9k mRNA相對表達水平的影響

吳文旋　吳佳?！埣d　莘海亮　楊　藝　朱倫琴

(1.貴州大學動物科學學院，貴州大學新農村發(fā)展研究院，貴陽550025；2.貴州省草業(yè)研究所，貴陽550006；3.江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌330200;4.黔東南民族職業(yè)技術學院，凱里556000)

飼糧陰陽離子差水平對小鼠血鈣濃度及胃腸道組織鈣結合蛋白-D9k mRNA相對表達水平的影響

吳文旋1吳佳海2*張吉鹍3*莘海亮4楊藝1朱倫琴1

(1.貴州大學動物科學學院，貴州大學新農村發(fā)展研究院，貴陽550025；2.貴州省草業(yè)研究所，貴陽550006；3.江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌330200;4.黔東南民族職業(yè)技術學院，凱里556000)

摘要：本試驗在前期建立了動物胃腸道鈣代謝相關基因表達水平檢測體系與表達譜分析的基礎上，旨在進一步確定飼糧陰陽離子差(DCAD)水平對動物血鈣濃度和胃腸道組織鈣結合蛋白-D9k(CaBP-D9k)mRNA相對表達水平的影響，為揭示低DCAD水平防治動物低血鈣癥的作用機制提供依據。將120只昆明小鼠隨機分為3組，每組40只，自配種前3 d起分別飼喂DCAD水平為+300(高DCAD水平組，HD組)、+150(對照組，CON組)、-50(低DCAD水平組，LD組)的飼糧。檢測母鼠產前20 d(-20 d)、產前5 d(-5 d)、產后當天(0 d)、產后3 d(+3 d)血鈣濃度和胃腸道組織CaBP-D9k mRNA相對表達水平。結果表明，與HD組相比，LD組顯著提高了圍產期內0 d、+3 d小鼠血鈣濃度(P<0.05)，顯著上調了小腸腸段(十二指腸、空腸、回腸)與結腸CaBP-D9k mRNA相對表達水平(P<0.05)，這一效應在-5 d、0 d表現最為顯著(P<0.05)，并在+3 d提高了小鼠空腸與結腸的CaBP-D9k mRNA相對表達水平(P<0.05)。統(tǒng)計結果顯示，十二指腸、空腸與結腸3個位點的CaBP-D9k mRNA相對表達水平與DCAD水平、血鈣濃度具有顯著的關聯性(P<0.05)。由此可見，降低DCAD水平可上調動物小腸及結腸腸段CaBP-D9k mRNA相對表達水平，同時伴隨更高的血鈣濃度。這可能是低DCAD水平有效維持動物圍產期血鈣穩(wěn)恒，降低低血鈣發(fā)生率的重要途徑。

關鍵詞：飼糧陰陽離子差；血鈣濃度；鈣結合蛋白；胃腸道組織

產前低飼糧陰陽離子差(dietary cation-anion difference, DCAD)水平可有效維持哺乳動物圍產期臨產血鈣穩(wěn)恒，加快產后血鈣水平的恢復速度，減少其臨床性低血鈣及后續(xù)代謝疾病的發(fā)生率，成為防治低血鈣癥的有效措施。研究認為，低DCAD水平可促進骨鈣入血[1]，減少尿鈣排泄[2]，促進胃腸道鈣吸收[3]，繼而有效促進機體血鈣穩(wěn)恒[4]，維持正常血鈣水平，最終預防低血鈣癥。但其詳細機理目前尚不明確，仍是動物營養(yǎng)學領域的重要研究課題，對解決該問題提高動物生產性能具有重要的現實意義。在哺乳動物血鈣穩(wěn)恒的三大途徑中，腎重吸收對機體鈣負平衡響應最快，可在數分鐘內調節(jié)，但尿液中鈣含量少，重吸收能力有限[5-6]，通常認為對機體外周循環(huán)鈣補充貢獻不大；骨溶解響應速度最慢，常需1周以上，且以發(fā)生食糜鈣吸收不足為前提[7]，不是短期內促進鈣穩(wěn)態(tài)的有效因素；與此不同，食糜鈣在胃腸道各區(qū)段上皮細胞吸收后，經毛細血管入血[7]，對血鈣平衡狀態(tài)的反應在短期內即可觀測到[8]，在血鈣穩(wěn)態(tài)維持過程中占有重要地位。正常生理狀態(tài)下，胃腸道吸收途徑是短期內補充外周循環(huán)鈣質，迅速維持血鈣穩(wěn)態(tài)最為可能的途徑[9]。

作為介導胞內鈣轉運至基底膜的重要元件，維生素D依賴型的鈣結合蛋白-D9k(calcium binding proteins-D9k, CaBP-D9k)隸屬于EF臂(EF-hand)鈣結合蛋白家族，是調控哺乳動物骨骼、腎臟、胃腸道鈣代謝過程中動力學參數的關鍵生物大分子，具備與鈣特異結合的能力。CaBP-D9k主要在胃腸道、腎、骨骼等鈣轉運相關組織中特異表達[10]。研究表明，腸道不同片段CaBP-D9k的表達水平與該位點鈣攝取能力呈強正相關[11-12]；老年人腸鈣吸收能力減弱，與CaBP-D9k表達水平的減少高度相關[13]；CaBP-D9k的表達位點及相對表達水平與所在器官/組織的鈣吸收能力存在密切正相關[14]。上述研究為闡明低DCAD水平有效預防低血鈣的作用機理提供了積極的借鑒意義。然而，截至目前鮮見不同DCAD水平與動物胃腸道組織CaBP-D9k表達水平的研究報道，不利于圍產期動物血鈣水平營養(yǎng)干預及其動力學過程的深層次理解。為此，本文在建立了胃腸道鈣代謝相關基因表達水平檢測體系與其表達譜的基礎上[12,15]，以小鼠為模式動物，從組織水平上研究低DCAD水平對其胃腸道組織CaBP-D9kmRNA相對表達水平的影響，旨在為揭示低DCAD水平防治低血鈣的分子機制提供依據。

1材料與方法

1.1主要試劑

1.2試驗動物管理與分組

選擇10周齡清潔級健康雌性昆明小鼠120只(貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供)，按隨機區(qū)組試驗設計平均分為3組，每組40只。自配種前3 d(預試期)分別飼喂DCAD水平為+300(基礎飼糧+NaHCO3，高DCAD水平組，HD組)、+150(基礎飼糧，對照組，CON組)、-50(基礎飼糧+NH4Cl，低DCAD水平組，LD組)的飼糧。小鼠滅菌飼糧由蘇州市雙獅實驗動物飼料科技有限公司提供。依照DCAD=Na+K-Cl-S計算DCAD水平[7]。小鼠籠飼，每籠4只，自由采食及飲水。小鼠基礎飼糧由玉米、豆粕、麩皮、多維、微量元素組成，主要營養(yǎng)水平為：粗蛋白質(CP)20.5%、粗灰分(Ash)6.9%、中性洗滌纖維(NDF)13.1%、酸性洗滌纖維(ADF)7.5%、鈣0.51%、磷0.40%。

1.3樣品采集

分別于小鼠配種次日(-20 d)、預產前5 d(-5 d)、產仔當天(0 d)、產后3 d(+3 d)每組隨機抽取10只，乙醚麻醉后摘除眼球處死。搜集小鼠眼眶血，3 000 r/min離心20 min制備血漿，置于-20 ℃保存；無RNase環(huán)境下迅速采集小鼠胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸樣本，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后投入預注入RNA Store的凍存管。所有樣本均于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4指標測定

按試劑盒說明書測定小鼠血鈣濃度。依照本課題組已建立的熒光定量PCR檢測體系[24]測定并計算各組小鼠不同時間點各組織CaBP-D9kmRNA相對表達水平。

1.5數據處理

數據采用平均值±標準差表示。使用SAS 9.3進行統(tǒng)計。其中，小鼠血鈣濃度的平均值調用Proc GLM模塊進行Duncan氏法檢驗；mRNA表達水平歸一化及相對表達水平計算依照前人報道進行[16]；為考察DCAD水平對上述指標的處理效應(treatment effects)、時間效應(time effects)及其交互作用(interaction)，在GLM程序中加入LSMEANS、TDIFF及PDIFF選項以比較檢測指標的差異。調用Proc REG及CORR模塊對DCAD水平、小鼠孕期血鈣濃度及胃腸道不同位點CaBP-D9kmRNA的相對表達水平進行Pearson線性相關分析。差異顯著水平設為P<0.05。

2結果

2.1血鈣濃度

如圖1所示，隨著分娩的臨近，小鼠血鈣濃度緩慢增加，在-5 d達到峰值，之后逐漸降低。與-5 d相比，0 d時各組小鼠血鈣濃度分別下降了17.68%(HD組)、25.83%(CON組)、6.59%(LD組)。產仔后(+3 d)，小鼠血鈣濃度均呈現恢復的趨勢，但LD組顯著高于其余2組(P<0.05)。此外，整個試驗期間，HD、CON、LD組小鼠平均血鈣濃度分別為1.052、1.209、1.525 mmol/L，以LD組最高，0和+3 d時顯著高于HD、CON組(P<0.05)，HD、CON組之間差異不顯著(P>0.05)。小鼠產仔時間效應及其與DCAD水平的互作效應均未對小鼠血鈣濃度產生顯著影響(P>0.05)。

不同折線數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in different polyline with the same small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖1DCAD水平對圍產期小鼠血鈣濃度的時間效應

Fig.1Time effects of DCAD level on plasma Ca2+concentration of mice during the transition period

2.2胃腸道CaBP-D9kmRNA相對表達水平

以試驗開始時各組的同一樣本為參照，圍產期內小鼠胃腸道CaBP-D9kmRNA相對表達水平變化見圖2。試驗開始后，胃CaBP-D9kmRNA相對表達水平隨產仔期臨近而逐漸降低，在產仔0 d達最低水平。與此不同，在-5 d與產仔0 d，十二指腸CaBP-D9kmRNA相對表達水平達到最大，顯著高于-20 d和+3 d(P<0.05)?？漳c、回腸、盲腸及結腸的CaBP-D9kmRNA相對表達水平在-5 d時大幅降低，之后逐漸上調至產仔0 d水平并升至最高點。產仔+3 d，小鼠胃腸道組織各位點CaBP-D9kmRNA相對表達水平均逐漸降至-20 d水平。

2.3DCAD水平與胃腸道CaBP-D9kmRNA相對表達水平的效應分析

由圖3可見，DCAD水平對胃腸道CaBP-D9kmRNA相對表達水平的效應僅在十二指腸、空腸、回腸及結腸4個位點被觀測到。試驗開始后，與HD組相比，LD組誘導了十二指腸、空腸、結腸內的CaBP-D9kmRNA相對表達水平顯著升高(P<0.05)；在十二指腸與結腸腸段，該效應一直延續(xù)到產仔0 d(P<0.05)。產后+3 d，與HD組相比，LD組顯著提高了小鼠十二指腸、空腸與結腸內CaBP-D9kmRNA相對表達水平(P<0.05)。進一步統(tǒng)計結果顯示(表1)，十二指腸、空腸與結腸3個組織位點CaBP-D9kmRNA相對表達水平與DCAD水平、血鈣濃度具有顯著的關聯性(P<0.05)，即DCAD水平降低/血鈣濃度增加，CaBP-D9kmRNA相對表達水平相應增加。

3討論

3.1DCAD水平對圍產期鼠血鈣穩(wěn)恒的影響

機體血鈣穩(wěn)恒是保障神經傳導、肌肉收縮、信號轉導等生理機能的前提，也是滿足骨骼及動物產品所需鈣質的基礎。無論是維生素D代謝及激活系統(tǒng)響應能力弱化[17]，還是短期內鈣流失過多[18]，均將打破機體血鈣穩(wěn)恒，誘發(fā)一系列鈣負平衡癥狀。在外源/自身因素導致血鈣平衡發(fā)生紊亂時，機體可在組織水平上調控甲狀旁腺激素(PTH)、1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]分泌[7]，提高腎重吸收、骨動員、胃腸道吸收三大鈣吸收途徑效率[6,8,19]調控機體可交換鈣庫(TEP)釋放/蓄積過程的動力學參數[5]，最終緩和血鈣水平波動幅度。

有學者指出[5]，胃腸道主動鈣吸收能力的弱化，可能是鈣代謝率旺盛動物圍產期內頻發(fā)低血鈣癥的分子病理學基礎，而低DCAD水平可通過上調動物胃腸道主動跨膜鈣攝取能力補充TEP所需的鈣源。這一觀點得到了國內外營養(yǎng)學界的廣泛關注，但相關作用研究匱乏。為驗證該假說，本試驗利用圍產期小鼠為模式動物，以鈣跨膜吸收通路的限速步驟關聯大分子CaBP-D9k為研究對象，檢測其在胃腸道不同位點的CaBP-D9kmRNA相對表達水平，并觀察受試動物血鈣濃度的變化，以考察不同DCAD水平對胃腸道組織鈣吸收的營養(yǎng)干預作用，發(fā)現小鼠血鈣濃度隨DCAD水平的降低而呈現出劑量-效應關系，且LD組血鈣濃度顯著高于其余2組。與此一致，前人研究結果表明，血鈣濃度增加是圍產期泌乳動物采食低DCAD水平后最為經典的效應[20]。

數據柱標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.01)。下圖同。

Value columns with the same small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖2DCAD水平對圍產期小鼠胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸組織CaBP-D9kmRNA相對表達水平的影響

Fig.2Effects of DCAD level onCaBP-D9kmRNA relative expression level of stomach, duodenum,jejunum, ileum, cecum and colon of mice during the transition period

就圍產期時段而言，試驗開始初期產生的鈣需求對小鼠體內血鈣應激不大，低DCAD水平對血鈣濃度變化有限。這可能是該采樣時間點3組小鼠血鈣差異不顯著的原因。隨著胎兒發(fā)育進程的不斷延伸，母體血容量逐步提高[21]；與此同時，鈣開始大量進入胎盤。為抑制血鈣負平衡，機體PTH及1,25-(OH)2D3分泌增加[7]，促進骨鈣動員入血，上調腸道鈣攝取能力，減少尿鈣排泄，維持動物血鈣濃度繼續(xù)上升[21]。這與本試驗中小鼠在-5 d時的血鈣濃度結果一致。得益于低DCAD水平對胃腸道鈣吸收調控作用的激活[5]，LD組小鼠血鈣濃度較前一時間段甚至有顯著提高。此外，盡管泌乳量較奶牛有限，圍產期小鼠仍有部分血鈣經乳腺合成初乳而流失，使母體難以迅速補充TEP維持正常血鈣濃度，最終導致3組小鼠在產仔時血鈣濃度有較大降幅；但LD組小鼠產仔0 d血鈣濃度降幅低于HD、CON組，提示其外周循環(huán)鈣容量/轉運效率得到提升。這可由該組小鼠在產前-5 d前就呈現的高血鈣濃度得到印證。同時，就最經典的指標血鈣來看，該試驗結果與前人的研究結論一致[22]，即低DCAD水平有利于減緩圍產期動物血鈣降低的程度，提高血鈣濃度，維持機體血鈣穩(wěn)恒。由此再次說明，低DCAD水平可提高圍產期動物血鈣濃度，防治低血鈣癥。

圖3　DCAD水平對圍產期小鼠不同采樣時段胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸

3.2DCAD水平對圍產期鼠胃腸道組織CaBP-D9kmRNA相對表達水平的影響

酸化機體內環(huán)境(pH降低)是低DCAD水平的另一主要特征。經典理論認為，低體液pH有利于骨鈣溶解入血[23]、促進胃腸道鈣吸收[24]。據此，我們考察了胃腸道CaBP-D9kmRNA相對表達水平對不同DCAD水平的響應情況。研究結果表明，胃與盲腸CaBP-D9kmRNA相對表達水平對DCAD水平響應幅度未達顯著水平。這與胃不是鈣吸收的主要器官有關[25]；同時，盲腸解剖學長度短，對鈣的主動/被動跨膜吸收貢獻有限?？傮w而言，這提示胃與盲腸對低DCAD水平調控圍產期小鼠血鈣濃度的營養(yǎng)干預作用有限。

表1　圍產期鼠胃腸道組織不同位點CaBP-D9k mRNA相對表達水平與DCAD水平、血鈣濃度的關聯分析

小鼠攝入低DCAD水平后，小腸及結腸腸段CaBP-D9kmRNA相對表達水平在產仔后3 d即迅速上調，其趨勢在分娩后仍得以延續(xù)。具體而言，進入妊娠期后，低DCAD水平誘導了除胃及盲腸腸段外其他位點更高的CaBP-D9kmRNA相對表達水平，在產仔0 d尤為突出，甚至表現出明顯的劑量-效應關系?？梢酝茢?，在小鼠上述組織內，低DCAD水平誘導了更多的食糜鈣進入上皮細胞，表明這些位點的鈣主動跨膜吸收能力得到了增強，有利于維持動物血鈣穩(wěn)恒。這已在LD組小鼠血鈣濃度變化中得到了印證，亦與低DCAD水平可在2 d左右激活動物血鈣穩(wěn)恒的表觀反應結論相符[5]。同時，進一步統(tǒng)計分析可見，十二指腸、空腸與結腸3個位點的CaBP-D9kmRNA相對表達水平對DCAD水平、血鈣濃度存在較強的關聯性。日本學者報道，小腸腸段CaBP-D9kmRNA相對表達水平與血鈣存在具備統(tǒng)計學意義的線性關系[26]，其關聯度(P=0.326,R2=0.053)略高于本研究，這可能與我們采用了不同的回歸分析手段(Spearman秩回歸 VS. Pearson’ s分析)有關。

可以看出，各組小鼠試驗初期(-20 d)血鈣濃度雖無統(tǒng)計學差異，但與高DCAD水平、對照相比，低DCAD水平對十二指腸、空腸與結腸CaBP-D9kmRNA相對表達水平的上調已達到顯著水平，以結腸腸段最為明顯。這正好佐證了在血鈣穩(wěn)態(tài)三大調節(jié)機制中，胃腸道鈣吸收響應速度快，可在機體發(fā)生鈣代謝紊亂前啟動調控，滿足TEP補充/消耗所需這一理論[5,7]。有趣的是，待產小鼠(-5 d)血鈣濃度雖較上一時間段增加，但除十二指腸外，其余組織位點CaBP-D9kmRNA相對表達水平并未上調。與之相反，其余腸段CaBP-D9kmRNA相對表達水平在該時間點明顯降低。結合胃腸道不同區(qū)段的特異鈣攝取模式的報道[27]，可以推測，該時段母體對鈣質的需求尚未達到最高點；同時，腸段CaBP-D9kmRNA相對表達水平下調，可能與在這些位點上其余跨膜鈣攝取相關基因的代償性高表達有關[28-29]。據此，有理由認為，在整個胃腸道內，十二指腸、空腸及回腸區(qū)段是影響圍產期哺乳動物母體血鈣穩(wěn)恒的主要靶位點；今后可繼續(xù)開展蛋白表達模式、鈣凈轉運率等研究。

綜上所述，基于DCAD水平對體液酸堿平衡、血液礦物元素穩(wěn)態(tài)的研究報道，筆者認為，小鼠胃腸道的4個位點(十二指腸、空腸、回腸、結腸)的CaBP-D9kmRNA相對表達水平的上調與低DCAD水平的生理調控作用緊密相關。這提示低DCAD水平具備上調胃腸道鈣主動跨膜吸收途徑關鍵限速大分子的能力；此外，胃腸道主動鈣吸收途徑相關生物大分子的表達上調，可能是低DCAD水平有效維持正常血鈣濃度的重要途徑。

4結論

本研究表明，低DCAD水平可上調圍產期小鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸組織CaBP-D9kmRNA相對表達水平，進而提高臨近分娩時段血鈣濃度。

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(責任編輯武海龍)

Effects of Dietary Cation-Anion Difference Level on Plasma Calcium Concentration and Gastrointestinal Tract Tissues Calcium Binding Proteins-D9k mRNA Relative Expression Level of Mice during the Transition Period

WU Wenxuan1WU Jiahai2*ZHANG Jikun3*XIN Hailiang4YANG Yi1ZHU Lunqin1

(1. College of Animal Science, Institute of New Rural Development, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Guizhou Institute of Prataculture, Guiyang 550006, China; 3. Institute of Animal Science,Jiangxi Academy of Agricultrual Sciences, Nanchang 330200, China; 4. Qiandongnan National Polytechnic, Kaili 556000, China)

Abstract:Based on the calcium related gene expression profile and its analysis, the study was conducted to investigate the effects of dietary cation-anion difference (DCAD) level on plasma calcium concentration and gastrointestinal tract tissues calcium binding proteins-D9k (CaBP-D9k) relative expression level of mice during the transition period, and to clarify the mechanism of low DCAD level prevent hypocalcaemia. One hundred and twenty KM mice were randomly allotted into 3 groups with 40 mice in each group, mice in the 3 groups were fed 3 diets with DCAD level at +300 (high DCAD level group, HD group), +150 (control group, CON group), and -150 (low DCAD level group, LD group), respectively. Plasma calcium concentration and gastrointestinal tract tissues CaBP-D9k mRNA relative expression level were detected at 4 time points: day of 20 (-20 d) and 5 (-5 d) before kidding, day of kidding (0 d), and day of 3 after kidding (+3 d). The results showed that compared with the HD group, the plasma calcium concentration of mice at 0 d and +3 d during the transition period in LD group was significantly increased (P<0.05), and the CaBP-D9k mRNA relative expression level was significantly up-regulated in duodenum, jejunum, ileum and colon (P<0.05), especially observed on -5 d before parturition and 0 d at parturition (P<0.05). Also, CaBP-D9k mRNA relative expression level was significantly increased in jejunum and colon on the +3 d after parturition (P<0.05). Moreover, there was a significant correlation between CaBP-D9k mRNA relative expression level in duodenum, jejunum and colon and plasma calcium concentration. In conclusion, low DCAD level is able to up-regulate CaBP-D9k mRNA relative expression level in small intestine and colon, accompany with greater plasma calcium concentration. This is possibly an important way of low DCAD level maintains plasma calcium homeostasis during the transition period, and reduce the occurrence rate of hypocalcemia.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(6)：1726-1734]

Key words:dietary cation-anion difference; plasma calcium concentration; calcium-binding protein; gastrointestinal tract tissues

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.06.013

收稿日期：2015-12-28

基金項目：國家自然科學基金(31360563)；貴州大學科技興村人才培育基地建設項目；貴州山區(qū)牧草產業(yè)化生產技術研究集成與應用(黔科合重大專項字〔2014〕6017號)；動物營養(yǎng)學國家重點實驗室開放課題(2004DA125184F1115);貴州省農業(yè)科技攻關項目(黔科合NY字[2009]3085)

作者簡介：吳文旋(1979—)，男，貴州安順人，教授，博士，從事反芻動物營養(yǎng)的教學與科研工作。E-mail: wwx3419@126.com *通信作者：吳佳海，研究員，E-mail: wujiahai2003@aliyun.com； 張吉鹍，研究員，E-mail: 346884018@qq.com

中圖分類號：S811.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)06-1726-09

*Corresponding authors: WU Jiahai, professor, E-mail: wujiahai2003@aliyun.com; ZHANG Jikun, professor, E-mail: 346884018@qq.com