子宮動脈灌注栓塞化療治療對宮頸癌組織caspase-9表達的影響

孫海燕 陳勇華 王紹光

近年來，隨著新輔助化療的提出和血管性介入治療在婦科的應(yīng)用，宮頸鱗狀細胞癌患者的預(yù)后已有較大改善。目前，對宮頸鱗狀細胞癌子宮動脈灌注栓塞化療療效的評價，臨床研究多局限于臨床療效和病理學(xué)[1]，基礎(chǔ)研究方面則以臨床藥代動力學(xué)為主[2]，而有關(guān)子宮動脈灌注栓塞化療后進一步治療時機的文獻報道較少。本研究選擇與細胞凋亡密切相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)[3,4,5]作為研究對象，觀察其變化，探討介入治療前后宮頸鱗癌細胞凋亡的動態(tài)變化，為后續(xù)進一步治療選擇最佳治療時機提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、臨床資料

納入2012年6月至2013年12月在煙臺毓璜頂醫(yī)院接受治療的宮頸鱗狀細胞癌患者50例，患者年齡(43.2±9.2)歲，病理均為鱗狀細胞癌，按FIGO 2009年宮頸癌臨床分期：IB2期18例、ⅡA期12例、ⅡB期20例。

二、研究標(biāo)本

所有患者均簽署知情同意書，均接受雙側(cè)子宮動脈灌注化療栓塞術(shù)，化療方案選擇對宮頸癌療效比較明確的順鉑70mg·m-2+博萊霉素45mg[6]，栓塞劑選擇直徑350μm～560μm的明膠海綿顆粒。術(shù)中超選擇插管至子宮動脈后，2/3藥量均分后行雙側(cè)子宮動脈灌注，1/3藥量與新鮮明膠海綿顆粒、造影劑相混合進行栓塞。于子宮動脈灌注化療栓塞治療前、介入后第7天、第14天和第21天用宮頸活檢鉗咬取宮頸新鮮癌組織一塊，約0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm。

三、試驗方法

試劑Caspase-9試劑盒、免疫組化SABC試劑盒(一抗為兔抗人IgG)、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程公司，具體操作同說明書。

四、免疫組化結(jié)果判定

染色后的切片采用雙盲法觀察，每張玻片隨機觀察3個視野。細胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性，將染色強度分為4級：0級無黃色顆粒，1級為淡黃色顆粒，2級為黃色顆粒，3級為棕色顆粒，分別賦值為0、1、2、3分；將細胞染色陽性百分比分為3級，0～25%為1級，26%～50%為2級，>50%為3級，分別賦值為1、2、3分。兩者評分相加為最終得分。

五、介入治療療效標(biāo)準(zhǔn)

按WHO療效判定標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解(CR)：腫瘤病灶消失；部分緩解(PR)：腫瘤病灶最大徑及其垂直徑的乘積減少>50%；無變化(NR)：腫瘤病灶最大徑及其垂直徑的乘積縮小25%，或增大25%，但無新病灶出現(xiàn)。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、宮頸鱗癌癌灶組織caspase-9在子宮動脈灌注化療栓塞治療前后的動態(tài)表達

子宮動脈灌注化療栓塞術(shù)治療前、治療后第7天、第14天和第21天的宮頸鱗癌癌灶組織caspase-9的表達評分如表1所示，四組數(shù)據(jù)比較可知隨治療后時間的推延，caspase-9的表達逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=152.25，P<0.05)，其中治療后第14天和第21天caspase-9的表達相近，無明顯差異,但明顯高于治療后第7天，治療前caspase-9的表達最低。

表1 子宮動脈灌注化療栓塞治療前后宮頸鱗癌癌灶組織caspase-9的動態(tài)表達

*qd-a=18.17，P<0.05;qc-a=14.98，P<0.05;qb-a=30.02，P<0.05;qd-b=12.55，P<0.05; qc-b=13.50，P<0.05;qd-c=3.76，P>0.05

表2 不同期別的宮頸鱗狀細胞癌組織caspase-9在子宮動脈灌注化療栓塞治療前后的動態(tài)表達

二、不同期別的宮頸鱗狀細胞癌組織caspase-9在子宮動脈灌注化療栓塞治療前后的動態(tài)表達

子宮動脈灌注化療栓塞治療不同分期宮頸鱗狀細胞癌前后caspase-9的表達呈逐漸升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=256.16,P<0.05)，如表2所示。其中ⅠB2、ⅡA、ⅡB期宮頸鱗狀細胞癌組織介入治療前caspase-9的表達低于介入治療后；介入治療后第7天各期宮頸鱗狀細胞癌組織caspase-9表達低于介入治療后第14天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；介入治療后第14天，各期宮頸鱗狀細胞癌組織caspase-9的表達低于介入治療后第21天，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

子宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)治療以手術(shù)和放療為主，隨著新抗癌藥物的出現(xiàn)和用藥途徑的改進，近年來宮頸癌介入聯(lián)合新輔助化療已經(jīng)取得良好的臨床療效[7-9]。但介入治療后惡性腫瘤的消退是短暫的，動脈灌注化療對癌細胞的殺滅受藥物劑量影響，并在一定時期內(nèi)療效最為顯著，停止治療后，由于癌灶內(nèi)化療藥物濃度減少，其對癌細胞的作用相應(yīng)減小，細胞器退變可緩和，甚至亞致死的癌細胞可復(fù)活。而臨床實踐也發(fā)現(xiàn)宮頸癌介入治療后若超過一定時間再施行手術(shù)，癌灶周圍可出現(xiàn)明顯的纖維素滲出或形成纖維條索，增加手術(shù)切除困難。因此，必須把握住再次治療的時機，通過手術(shù)或者放療去除大部分殘留的癌細胞，改善患者的生存率和生存質(zhì)量。檢索國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，有關(guān)宮頸癌介入法新輔助化療療效的評價主要依靠臨床婦科檢查或影像學(xué)檢查如B超、CT、MR等[10]，并以此為根據(jù)估計手術(shù)時機：單純動脈灌注化療選擇在介入治療后3周，動脈灌注栓塞化療則在介入治療后4周。這種僅從病灶大小來判斷介入治療療效和確定手術(shù)時機的方法較片面且缺乏確切的理論基礎(chǔ)。因此，選擇較確切的指標(biāo)評價宮頸癌介入治療效果，并指導(dǎo)婦科醫(yī)師選擇合適的介入治療后手術(shù)時機是非常重要的，綜合國內(nèi)外文獻，本研究通過觀察宮頸鱗狀細胞癌組織caspase-9表達的動態(tài)變化，從分子水平來探討宮頸鱗癌介入治療后進一步治療的最佳時機[11]。

研究表明，人類和哺乳動物細胞的凋亡主要由半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族介導(dǎo)，由上游凋亡因子激活的半胱氨酸蛋白酶在線粒體內(nèi)引發(fā)的酶級聯(lián)效應(yīng)可促進DNA降解和細胞解體，其高度表達可引起細胞凋亡，因此被稱為“死亡蛋白酶”。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控細胞凋亡的caspase-8、9分別由其上游不同的凋亡因子啟動，并分別介導(dǎo)線粒體內(nèi)和線粒體外凋亡通路。caspase-8主要位于細胞膜內(nèi)側(cè)，可被臨近細胞膜的死亡信號復(fù)合體快速募集和激活。caspase-9位于線粒體外，可被線粒體釋放細胞色素C所激活。而被上游caspase-8、9激活的caspase-3通過以下機制促進細胞凋亡：降解凋亡抑制蛋白bcl-2蛋白，進而激活caspase-3形成級聯(lián)反應(yīng)；降解細胞外基質(zhì)蛋白和骨架蛋白；降解DNA修復(fù)相關(guān)分子。caspase-3一旦被激活，細胞凋亡即不可逆轉(zhuǎn)[12,13]。

本研究中，IB2-IIB期宮頸鱗狀細胞癌組織在介入前后都存在caspase-9的表達，這提示宮頸鱗癌細胞自然情況下也存在一定程度的凋亡，經(jīng)過介入治療后，在化療藥物和栓塞所致缺血缺氧的雙重作用下，宮頸鱗癌細胞caspase-9的表達顯著上調(diào)，提示癌細胞凋亡增加，這可能是宮頸鱗狀細胞癌介入治療的機制之一。介入治療后第14天，宮頸鱗癌細胞caspase-9的表達較介入后7天時有顯著增加，此時介入治療對宮頸鱗癌細胞的作用仍在繼續(xù)，介入治療后21天時，caspase-9的表達較介入治療后14天時上升，此時介入治療對宮頸鱗癌細胞的作用仍在繼續(xù)，此后一段時間維持在這一水平，這提示隨著癌組織中化療藥物的作用，介入治療的作用持續(xù)，癌細胞的凋亡維持在較高水平，局部腫瘤病灶可縮小，但介入治療對惡性腫瘤的消退和緩解的作用是短效的，在動脈灌注栓塞化療術(shù)后14～21天癌細胞凋亡增加維持較高水平時，需抓住進一步治療時機，因此宮頸鱗癌動脈灌注栓塞化療后2～3周時應(yīng)當(dāng)考慮進一步治療。

本研究結(jié)果顯示，caspase-9可以作為評價宮頸鱗狀細胞癌介入治療效果的分子生物學(xué)指標(biāo)。從癌組織局部caspase-9的動態(tài)變化來看，動脈灌注栓塞化療術(shù)后14～21天是進一步治療宮頸鱗狀細胞癌的最佳時機。

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