非小細胞肺癌患者血清DJ-1、sMICA水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系研究*

孔彥，田亮

（滄州市中心醫(yī)院1.檢驗科，2.病理科，河北 滄州061001）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌類型的75%～80%，盡管NSCLC治療技術(shù)不斷提高，但是病死率仍然較高，位居惡性腫瘤首位，尤其是晚期肺癌，5年生存率不到5%[1]。探討與NSCLC 預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物有助于指導(dǎo)臨床治療，提高肺癌患者生存率。DJ-1 蛋白是一種高度保守的可溶性蛋白，參與多種細胞通路，同時DJ-1 作為一種癌基因，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。腫瘤惡性進展的關(guān)鍵之一是腫瘤細胞獲得逃避免疫介導(dǎo)而使腫瘤細胞殺傷作用減弱[3]，MHC-I 類鏈相關(guān)蛋白A（MICA）是NK 細胞、T 細胞表面的跨膜糖蛋白，主要發(fā)揮應(yīng)激作用下的免疫應(yīng)答[4]?？扇苄訫HC-I 類鏈相關(guān)蛋白A（sMICA）由MICA 脫落而成，當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生時，可在外周血清檢測到sMICA 水平升高[5]。目前DJ-1、sMICA 與NSCLC 的相關(guān)報道十分少見，DJ-1、sMICA與NSCLC 預(yù)后關(guān)系尚不清楚，本研究檢測NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平，探討其與NSCLC 患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床治療、預(yù)后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月—2017年1月滄州市中心醫(yī)院收治的77 例NSCLC 患者為NSCLC 組。其中，男性51例，女性26例；年齡51～72歲，平均（63.35±4.21）歲；吸煙史53例；腫瘤直徑≥3 cm 41例，＜3 cm 36 例；病理類型：腺癌45 例，鱗癌32 例；分化程度：低中分化46 例，高分化31 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期35 例，Ⅲ、Ⅳ期42 例；淋巴轉(zhuǎn)移23 例，遠處轉(zhuǎn)移19 例。另選取同期本院50 例體檢健康者為對照組。其中，男性38例，女性12 例；年齡50～71 歲，平均（63.01±4.15）歲；吸煙史19 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①支氣管鏡或空芯針肺穿刺活檢病理學(xué)證實為NSCLC；②初次診斷NSCLC；③臨床病理資料完整，配合隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實為其他類型肺癌；②入組前已經(jīng)接受手術(shù)、化療、放療等治療；③合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤；④合并肺結(jié)核、嚴重肝腎功能不全。NSCLC 組年齡、性別與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；NSCLC 組吸煙史與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.737，P=0.001），NSCLC 組高于對照組。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

NSCLC 患者入組后24～72 h 采集靜脈血5 mL，對照組于體檢當(dāng)日采集，置于TG16-Ⅱ臺式高速離心機（湖南平凡科技有限公司）4℃3 000 r/min 離心20 min（離心半徑10 cm），取血清保存于-70℃低溫冰箱（美國Thermo 公司），48 h 內(nèi)完成待檢。取出樣本后，4℃緩慢復(fù)融，采用RT6000 酶標(biāo)儀（深圳霄杜生命科學(xué)有限公司），應(yīng)用酶鏈免疫吸附試驗檢測血清DJ-1、sMICA 水平，試劑盒購自上海博華生物試劑公司。上述檢驗均由本院檢驗中心完成，試劑批內(nèi)變異控制在6.0%以內(nèi)。

1.3 隨訪

所有NSCLC 患者均定期隨訪至2020年1月，每3 個月隨訪1 次，隨訪以門診復(fù)查、電話或微信形式進行。以腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡為預(yù)后不良，統(tǒng)計隨訪期間患者無疾病進展生存（progression-free survival, PFS）和總體生存（overall survival, OS）情況。PFS 定義為自病理確診至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡的時間。OS 定義為自病理確診至各種原因引起的死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗；影響因素的分析采用Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較

兩組血清sMICA、DJ-1 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），NSCLC 組高于對照組。見表1。

表1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較 （±s）

表1 兩組血清DJ-1、sMICA水平比較 （±s）

組別n DJ-1/（ng/mL）sMICA/（pg/mL）NSCLC組對照組t 值P 值77 50 18.24±3.19 4.12±1.03 36.054 0.000 146.35±22.16 31.26±7.05 42.390 0.000

2.2 血清DJ-1、sMICA 水平與NSCLC 患者臨床病理特征的關(guān)系

不同臨床病理特征NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低中度分化、有淋巴轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移患者血清DJ-1 水平均高于高度分化、無淋巴轉(zhuǎn)移、無遠處轉(zhuǎn)移患者；TNM 分期Ⅲ和Ⅳ期、低中度分化、有淋巴轉(zhuǎn)移患者血清sMICA 水平均高于TNM 分期Ⅰ和Ⅱ期、高度分化、無淋巴轉(zhuǎn)移患者。見表2。

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比較 （±s）

表2 不同臨床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比較 （±s）

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2.3 不同血清DJ-1、sMICA 水平NSCLC 患者的預(yù)后

建立NSCLC 患者Kaplan-Meier 生存分析模型，根據(jù)DJ-1、sMICA 均值將NSCLC 患者分為高DJ-1水平組36 例（DJ-1≥18.24 ng/mL），低DJ-1 水平組41 例（DJ-1 ＜18.24 ng/mL）、高sMICA 水平組43 例（sMICA ≥146.35 pg/mL）、低sMICA 水平組34 例（sMICA ＜146.35 pg/mL）。Kaplan-Meier 生存曲線見圖1、2。經(jīng)Log rank χ2檢驗，高DJ-1 水平組NSCLC患者PFS 生存率、OS 生存率分別為52.78%（19/36）、58.33%（21/36），低于低DJ-1 水平組的92.68%（38/41）、95.12%（39/41）（χ2=7.346 和6.348，P=0.007 和0.012），高sMICA 水平組NSCLC 患者PFS 生存率、OS生存率分別為60.47%（26/43）、65.12%（28/43），低于低sMICA 水平組的91.18%（31/34）、94.12%（32/34）（χ2=7.433 和6.297，P=0.006 和0.012）。

圖1 不同血清DJ-1水平NSCLC患者PFS、OS生存曲線圖

2.4 NSCLC患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

以NSCLC 患者預(yù)后不良（0 =否，1 =是，t =生存期）為因變量，納入年齡（1 ≤60 歲，2 ≥60 歲）、性別（1=女，2=男）、吸煙史（1=無，2=有）、腫瘤直徑（1 ≤3 cm，2 ≥3 cm）、病理類型（1=腺癌，2=鱗癌）、分化程度（1=高度分化，2=低中度分化）、TNM 分期（1=Ⅰ、Ⅱ期，2=Ⅲ、Ⅳ期）、淋巴轉(zhuǎn)移（1 =否，2 =是）、遠處轉(zhuǎn)移（1=否，2 =是）、sMICA（1 ≤146.35 pg/mL，2 ≥146.35 pg/mL）、DJ-1（1 ≤18.24 ng/mL，2 ≥18.24 ng/mL）為自變量，納入多因素Cox回歸模型（逐步后退法，α入=0.05，α出=0.10），結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（=1.697，95% CI：1.421，1.953）、分化程度（=1.344，95% CI：1.194，1.648）、DJ-1 水平（=1.831，95% CI：1.652，2.354）和sMICA 水平（=2.164，95%CI：2.012，3.956）是NSCLC 患者預(yù)后不良的影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

圖2 不同血清sMICA水平NSCLC患者PFS、OS生存曲線圖

3 討論

NSCLC 是最常見的肺癌類型，我國2014年新發(fā)肺癌病例78.1 萬，死亡62.6 萬，居男性腫瘤發(fā)病率和病死率首位，居女性腫瘤發(fā)病率第二位、病死率第一位[6]。NSCLC 早期診斷率低，確診患者多數(shù)已處于中晚期，約50%患者生存狀況較差[7]。腫瘤細胞分化程度、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為是導(dǎo)致治療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)、患者死亡的重要因素。識別NSCLC與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)機制可為臨床分子靶向治療提供新的靶點，為預(yù)后評估提供準(zhǔn)確的信息，進而加強干預(yù)，達到改善預(yù)后目的。因此尋找預(yù)測NSCLC患者預(yù)后的非侵入性指標(biāo)十分重要。

DJ-1 屬絲裂原依賴性癌基因，位于染色體1p36.2-p36.3，分子量約20 kD，參與機體RNA 結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、腫瘤生成過程[8]?，F(xiàn)有研究顯示DJ-1 在直腸癌[9]、甲狀腺乳頭狀癌[10]、膠質(zhì)母細胞瘤[11]等多種惡性腫瘤表達升高，且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。DJ-1 是否能成為NSCLC 預(yù)后預(yù)測的潛在生物學(xué)指標(biāo)尚不確定，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 組血清DJ-1 水平高于對照組，DJ-1 在低中度分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠處轉(zhuǎn)移患者中水平明顯高于高度分化、無淋巴轉(zhuǎn)移、無遠處轉(zhuǎn)移患者，說明DJ-1 與NSCLC 惡性程度有關(guān)，參與NSCLC 侵襲、轉(zhuǎn)移過程。BAI 等[12]報告DJ-1 表達與NSCLC 淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，也驗證了DJ-1 參與NSCLC 轉(zhuǎn)移的過程。從Kaplan-Meier 生存曲線可以看出高水平DJ-1 患者PFS、OS 生存率偏低，Cox 回歸分析高水平DJ-1 與NSCLC 預(yù)后不良有關(guān)，經(jīng)進一步校正混雜因素，DJ-1仍與NSCLC 不良預(yù)后有關(guān)，提示DJ-1 水平升高可能促進NSCLC 高度侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后的發(fā)生，DJ-1 可能成為NSCLC 侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)，為臨床預(yù)后評估提供有效信息，并為NSCLC 分子靶向治療提供新的思路和方向。DJ-1 參與NSCLC 不良預(yù)后的機制：Jun 氨基末端激酶（JNK）通過B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）-Beclin1 復(fù)合物介導(dǎo)自噬反應(yīng)，抑制腫瘤細胞生長，DJ-1 通過JNK 依賴途徑改變自噬，調(diào)控Beclin1 參與的自噬反應(yīng)，DJ-1 過表達抑制JNK 和Bcl2 磷酸化，進而阻止Beclin1 和Bcl2 解離，促使腫瘤細胞增殖[13]。其次，DJ-1 通過張力蛋白同源的基因（PTEN）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）信號通路參與癌細胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)DJ-1 表達，腫瘤細胞G0/G1 期細胞數(shù)量增加，S 期細胞數(shù)量減少[14]。DJ-1 過表達可通過上調(diào)P-糖蛋白（P-gp）與凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進藥物主動外泄，導(dǎo)致化療耐藥，增強腫瘤細胞的抗凋亡能力[15]，最終導(dǎo)致疾病進展和不良預(yù)后發(fā)生。

MICA 是NK 和CD8 T 淋巴細胞表面激活受體——自然殺傷細胞2 族成員D（NKG2D）的配體，由MHC 基因編碼，分子量43 kD，表達于胸腺、胃腸道及腫瘤細胞表面，主要發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。當(dāng)腫瘤發(fā)生時MICA 通過與NKG2D 配體特異性結(jié)合傳遞活化信號，誘導(dǎo)以NK 細胞為主的免疫應(yīng)答，清除腫瘤細胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[16]。sMICA 是MICA 的可溶性形式，是MICA 脫落形成的游離狀態(tài)，MICA 脫落降低了MICA 水平，影響NKG2D 識別，進而誘導(dǎo)T 細胞表面和NK 細胞表面NKG2D 內(nèi)化、降解，影響NK 細胞的免疫監(jiān)測，促進腫瘤細胞免疫逃逸[17]，在腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮與MICA 相反的作用。有研究顯示sMICA在食管癌組織中過度表達，與TNM 分期、分化程度、化療療效均存在密切關(guān)系[18]，乳腺癌患者血清sMICA水平明顯升高，sMICA 水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)[19]。目前sMICA與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系尚不確定，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清sMICA水平也明顯升高，sMICA水平與NSCLC患者分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明sMICA參與NSCLC侵襲、轉(zhuǎn)移病理機制。生存分析和回歸分析結(jié)果證實高水平sMICA與NSCLC患者預(yù)后不良有關(guān)，sMICA可以作為NSCLC預(yù)后評估的一個參考指標(biāo)。sMICA參與NSCLC不良預(yù)后的機制可能為：腫瘤低氧微環(huán)境介導(dǎo)sMICA表達上調(diào)，通過阻斷NKG2D 通路來抑制NK 細胞對腫瘤細胞殺傷性，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促使腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[20]。楊斌等[21]報道顯示隨著肺癌患者血清sMICA 水平升高，NKG2D+CD8+NKT 細胞含量減少，sMICA 抑制NKG2D+CD8+NKT 功能活性，sMICA、NKG2D+CD8+NKT細胞共同作用下誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸過程。以上結(jié)果提示sMICA 異常升高可能是NSCLC 腫瘤細胞逃避NKG2D 介導(dǎo)免疫監(jiān)視的機制之一，抑制MICA 脫落可能下調(diào)sMICA水平，激活NK細胞為主的免疫效應(yīng)，達到清除腫瘤細胞的目的。

綜上所述，NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平均升高，高水平DJ-1、sMICA與NSCLC患者不良預(yù)后有密切關(guān)聯(lián)。DJ-1、sMICA可能為NSCLC患者預(yù)后評估提供參考，并為NSCLC治療提供新的靶點。