山西地區(qū)漢族人Graves病與PARP-1、STAT4基因多態(tài)的關(guān)聯(lián)研究

趙靜雅，梁文芳，賀美芳，王芳，蘭麗珍山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原　030001

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山西地區(qū)漢族人Graves病與PARP-1、STAT4基因多態(tài)的關(guān)聯(lián)研究

趙靜雅，梁文芳，賀美芳，王芳，蘭麗珍
山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001

［摘要］目的該實(shí)驗(yàn)通過對山西地區(qū)漢族人Graves病（GD）的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4（STAT4）基因多態(tài)性檢測，旨在從基因水平評估其在GD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）和基因測序方法分別對2015年4—7月流調(diào)人群中61例GD患者和50例健康人的PARP-1基因的1672位點(diǎn)和STAT4基因的rs7574865位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，比較兩組的基因型和基因頻率。結(jié)果PARP-1基因G1672A的GG型病人患GD病的風(fēng)險(xiǎn)有2.3倍高，基因頻率的比較，GD病患者的G頻率風(fēng)險(xiǎn)是正常對照組的1.452倍。通過測序回報(bào)結(jié)果，GD患者rs7574865的基因頻率T是健康對照組的1.744倍。結(jié)論Graves病與PARP-1、STAT4基因多態(tài)性有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］Graves病；聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4；多態(tài)性

Graves?。℅D）又稱彌慢性毒性甲狀腺腫，是甲亢中最常見的類型，占85％～90％。近年來，GD的研究取得了很大的進(jìn)展，其發(fā)病機(jī)制今仍未闡明。PARP-1增加使淋巴B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體的細(xì)胞因子，這種被認(rèn)為和GD的發(fā)病機(jī)制有很大關(guān)系［1］。調(diào)查關(guān)于自身免疫疾病和STAT4基因多態(tài)性，許多研究表明STAT4基性和自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩病有關(guān)系，因此預(yù)示著在大量自身免疫病有相同基因。該實(shí)驗(yàn)擬對GD人群及健康人群基因多態(tài)性的檢測，探討是否為山西地區(qū)漢族人GD易感性因素。GD組61例，對照組50例，GD組和健康組來自山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年4—7月流調(diào)人群。

1　對象與方法

1.1研究對象

GD組診斷符合：①甲狀腺功能亢進(jìn)（甲亢）的臨床癥狀、體征；②觸診時(shí)彌漫性對稱性甲狀腺腫大，質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)；③實(shí)驗(yàn)室檢查甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）及促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）陽性，I131攝碘率增高；④甲狀腺超聲檢查顯示甲狀腺對稱性腫大。對照組同樣來自流調(diào)人群中。所有入選的研究對象均排除近期有感染史、女性妊娠、嚴(yán)重并發(fā)癥、合并其它自身免疫性疾病史，成員之間有血緣關(guān)系。GD組61例，男16例，女45例，對照組50例，男13例，女37例，GD組來自山西第一醫(yī)院內(nèi)分泌科2015年4—7月流調(diào)人群中GD患者，年齡18～79歲，平均年齡（41±10）歲。兩組性別年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有研究實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會的批準(zhǔn)及受試者均簽署了書面知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本采集：所有研究對象均采集空腹靜脈血2 mL，用EDTA抗凝，保存于-80℃。

外周靜脈血DNA的提取用全血DNA提取試劑盒提取DNA，提取好的DNA存放于-20℃保存。

PCR擴(kuò)增目的基因PARP-1G1672A基因上游引物5-GCGAGACCCTGTCCCTAA-3，下游引物5-TCCCCCTTTTATTTTTGAGACTG-3。STAT-4rs757486基因上游引物：5-AGTATGAAAAGTTGGTGAC-3，下游引物：5-AATCCCCTGAAATTCCACTG- 3，反應(yīng)體系50 μL，包括：上下游引物各1 uL（20 μM），PrsmixTaqPCR25 μL，DNA模板（濃度為100 ng/μL）5 μL，ddH2O 18 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物于2％瓊脂糖電泳檢測。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型分析：PARP-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于37℃下在10 U的sh1236I孵育過夜，酶切產(chǎn)物在2％的瓊脂糖電泳下進(jìn)行基因型鑒定。STAT-4基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于基因公司進(jìn)行測序，收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper來分析。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

確定GD組和正常對照組基因頻率是否符合Hard-Weinberg遺傳平衡法則，并利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，各組間基因型及等位基因頻率比較采用四格表Χ2檢驗(yàn)。用比值比（OR）表示相對風(fēng)險(xiǎn)度。

2　結(jié)果

PARP-1基因G1672A的GG型患者患GD病的風(fēng)險(xiǎn)有2.3倍高（P=0.04），基因頻率的比較發(fā)現(xiàn)，GD病患者的G頻率風(fēng)險(xiǎn)是正常對照組的1.452倍。通過測序結(jié)果，GD患者rs7574865的基因頻率T是健康對照組的1.744倍（P=0.047＜0.05），見表1。

表1　

3　討論

PARP-1是一種核多功能酶和染色質(zhì)相關(guān)蛋白，它有113 kD重被1q41q42染色體區(qū)域編碼，PARP-1基因有23個(gè)外顯子。研究［2］表示SNPs（5q31-33）負(fù)責(zé)細(xì)胞因子（IL-3，IL-4，IL-5），可能是GD的危險(xiǎn)因素。最近關(guān)于炎癥相關(guān)疾病的提出PARP-1的大鼠現(xiàn)實(shí)PARP-1阻滯劑可以阻止疾病的發(fā)展和過程［3］，PARP-1組實(shí)際的保護(hù)作用是通過阻滯炎癥，說明PARP-1在炎癥是非常作用，并且通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)炎癥表達(dá)的［4］，越來越多的出版物表明，在SNPs和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制有很大關(guān)系［5］，SNP的促進(jìn)區(qū)，基因多態(tài)性可能影響了基因轉(zhuǎn)錄，該研究發(fā)現(xiàn)，對于G1672A基因多態(tài)性，GG型患者和攜帶G堿基的一組人容易有GD，有GG和G的患者是2.3和1.452倍，可以推斷出GA型對疾病有保護(hù)作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4 （STAT4）基因，位于人染色體2q32.3，包括一個(gè)橫跨120

kb區(qū)域的外顯子。STAT4基因傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄通過INF，IF-12，IF-15轉(zhuǎn)錄的［6］同時(shí)STAT4在引導(dǎo)T分化Th1細(xì)胞的IL-12分化因子有重要作用，并且通過Th17細(xì)胞參與的產(chǎn)生。目前人類證據(jù)表明STAT4涉及Th1或Th17為中介的疾病，并且和大量自身免疫疾病有相的易感基因，提供了調(diào)查GD的原因，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次提供了STAT4在山西人群組中的基因型。Rs7574865，位于STAT4的第3個(gè)區(qū)域，已經(jīng)被確定增加RA，SLE，T1D，Grons病和Behcet病風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)韓國研究表明［7］T基因頻率的GD患病率更高，其GD患者STAT4rs7574865基因頻率T風(fēng)險(xiǎn)率為2.01倍（P＜0.05），而該實(shí)驗(yàn)為1.744倍（p= 0.047），結(jié)果與該實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。綜上所述，Graves病與PARP-1、STAT4基因多態(tài)性有相關(guān)性。［8］這為我們從基因水平進(jìn)一步探討GD發(fā)病機(jī)制提供了思路。由于疾病發(fā)生涉及基因和環(huán)境共同影響，該實(shí)驗(yàn)只是初步研究，我們應(yīng)該繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，在更多的地區(qū)和種族間進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Research on Correlation between the Graves Disease in the Han Chinese of Shanxi Area

ZHAO Ya-jing，LIANG Wen-fang，HE Mei-fang，WANG Fang，LAN Li-zhen
Shanxi Medical University，Taiyuan，Shanxi Province，030001 China

［Abstract］Objective To evaluate the effect of the poly（adp-ribose）polymerase-1（PARP-1），signal transduction and activating transcription factor（STAT4）gene polymorphism in the GD pathogenesis by detecting them in Graves disease in the han Chinese of Shanxi area. Methods The 1672 loci in PARP-1 genes and rs7574865 loci in STAT4 genes from 61 cases of GD patients and 50 healthy cases in the epidemiological population from April 2015 to July 2015 were given genotyping according to the polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphisim and genetic sequencing method，and the genotype and gene frequency were compared between the two groups. Results The risk of suffering from GD disease of GG type PARP-1 patients with G1672A gene was 2.3 times as high as that of the normal control group，in terms of the gene frequency，the G frequency risk of the patients with GD disease was 1.452 times as high as that of the normal control group，the sequencing results showed that gene frequency T of rs7574865 in GD patients was 1.744 times as many as that of the normal control group. Conclusion There is a correlation between the Graves disease and PARP-1 and STAT4 gene polymorphism.

［Key words］Graves disease；Poly（adp -ribose）polymerase -1（PARP -1），signal transduction and activating transcription factor；Polymorphism

［中圖分類號］R5

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）05（b）-0054-03

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.054

［基金項(xiàng)目］甲狀腺疾病和碘營養(yǎng)狀況的山西調(diào)查（2014011043-4）。

［作者簡介］趙靜雅（1989.4-），女，山西太原人，碩士，在讀研究生，研究方向：糖尿病和甲狀腺疾病。

［通訊作者］蘭麗珍（1970-），女，山西太原人，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事糖尿病和甲狀腺疾病工作。

收稿日期：（2016-02-26）