中國(guó)人群細(xì)胞黏附相關(guān)基因多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)研究

袁　園，王　蘋，吳雅慧，葉曉茜，黃尚志，石　冰，王　科，王竹青，劉冬靜，王子凡，吳　濤△，王　紅

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京 100191； 2.北京市疾病預(yù)防控制中心信息統(tǒng)計(jì)中心，北京 100013； 3.林口長(zhǎng)庚紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，中國(guó)臺(tái)灣桃園市 33305； 4.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，武漢 430079； 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA； 6.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，北京 100005； 7.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 8.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔外科，山東青島 266000；9.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100191)

·論著·

中國(guó)人群細(xì)胞黏附相關(guān)基因多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)研究

袁園1，王蘋2，吳雅慧3，葉曉茜4,5，黃尚志6，石冰7，王科8，王竹青1，劉冬靜1，王子凡9，吳濤1△，王紅1

(1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，北京 100191； 2.北京市疾病預(yù)防控制中心信息統(tǒng)計(jì)中心，北京 100013； 3.林口長(zhǎng)庚紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，中國(guó)臺(tái)灣桃園市 33305； 4.武漢大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，武漢 430079； 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA； 6.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，北京 100005； 7.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 8.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔外科，山東青島 266000；9.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100191)

[摘要]目的：探索中國(guó)人群中細(xì)胞黏附相關(guān)基因多態(tài)性與非綜合征型唇裂合并或不合并腭裂(isolated non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)的關(guān)聯(lián)關(guān)系及可能存在的基因-環(huán)境交互作用。方法： 對(duì)一項(xiàng)國(guó)際多中心的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)的數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，選取其中806個(gè)中國(guó)人群NSCL/P核心家庭，對(duì)該人群的8個(gè)細(xì)胞黏附相關(guān)基因包括CDH1、CTNNB1、PVRL1、PVRL2、PVRL3、ACTN1、VCL、LEF1進(jìn)行了傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmisssion diseqilibrium test, TDT)及基因-環(huán)境交互作用分析。環(huán)境因素包括患兒母親孕期吸煙、被動(dòng)吸煙、飲酒及服用多種維生素。結(jié)果： 經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后，共納入226個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn)，TDT結(jié)果顯示，CTNNB1、CDH1、ACTN1基因中有23個(gè)SNPs與NSCL/P之間存在關(guān)聯(lián)(P<0.05)，但經(jīng)Bonferroni校正后，這些關(guān)聯(lián)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.000 2)。基因-環(huán)境交互作用的分析結(jié)果顯示，14號(hào)染色體的ACTN1基因中rs743127位點(diǎn)與母親孕期被動(dòng)吸煙的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1)，母親孕期無被動(dòng)吸煙時(shí)攜帶一個(gè)該危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值為0.59(95%CI:0.38-0.90)，患兒母親孕期中有被動(dòng)吸煙情況時(shí)攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值為2.00(95%CI:1.23-3.26)。而ACTN1基因的rs1475034、rs370535、rs2273419位點(diǎn)、CTNNB1基因的rs106871位點(diǎn)與被動(dòng)吸煙和PVRL3基因的rs7634000、rs2971366、rs2634553、rs1489032、rs7624812位點(diǎn)與母親孕期補(bǔ)充維生素的交互作用并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.000 2)。結(jié)論： 傳遞不平衡檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)所納入的細(xì)胞黏附相關(guān)基因多態(tài)性與NSCL/P存在關(guān)聯(lián)，但基因-環(huán)境交互作用分析結(jié)果提示，ACTN1基因可能通過基因-環(huán)境交互作用而影響NSCL/P的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

[關(guān)鍵詞]ACTN1；唇裂；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；基因相關(guān)性研究；基因-環(huán)境交互作用

非綜合征型唇裂合并或不合并腭裂(isolated non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)是最常見的出生缺陷之一。我國(guó)的唇腭裂發(fā)病率處于較高的水平，發(fā)病率約為1.20/1 000活產(chǎn)兒[1]。NSCL/P是一種由遺傳和環(huán)境共同影響的復(fù)雜疾病,由雙生子研究發(fā)現(xiàn)唇腭裂的遺傳度可以達(dá)到70%或更高[2]。2010年，核心家庭設(shè)計(jì)的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)發(fā)現(xiàn)歐洲及亞洲人群中8q24區(qū)域及IRF6基因與NSCL/P相關(guān)，此外新發(fā)現(xiàn)的候選基因有MAFB、ABCA4，潛在的候選基因?yàn)镻AX7、VAX1、NTN1[3]。2013年Beaty等[4]在歐洲和東南亞人群中對(duì)此前的GWAS研究中得出的基因進(jìn)行驗(yàn)證，IRF6、ABCA4、MAFB基因及8q24區(qū)域得到驗(yàn)證。但在NSCL/P的病因探索中，目前發(fā)現(xiàn)的易感基因并不能完全解釋NSCL/P發(fā)生的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，繼續(xù)探索其他候選基因?qū)ふ襈SCL/P的病因十分重要。

近年來，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附相關(guān)基因可能與唇腭裂發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[5-12]。細(xì)胞間黏附連接對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性十分重要，它可以限制細(xì)胞的移動(dòng)和擴(kuò)散。目前細(xì)胞黏附相關(guān)基因的研究熱點(diǎn)為CDH1和PVRL1。CDH1為鈣黏素的編碼基因，參與上皮細(xì)胞鈣依賴型細(xì)胞間黏附過程[13]。既往研究結(jié)果表明，CDH1中的rs16260和rs1801552可能與NSCL/P存在關(guān)聯(lián)[6-7]。參與上皮細(xì)胞黏附過程的PVRL1(脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因1)，也為非綜合征型唇腭裂的候選基因之一。該基因?qū)儆诿庖咔虻鞍壮易?，編碼黏連蛋白。多個(gè)人群研究顯示PVRL1突變與NSCL/P存在關(guān)聯(lián)[8-12]。以上研究結(jié)果提示細(xì)胞黏附分子可能通過影響上皮細(xì)胞間黏附過程而影響NSCL/P的發(fā)生。然而，關(guān)于細(xì)胞黏附相關(guān)基因是否與唇腭裂存在關(guān)聯(lián)的研究結(jié)論并不一致，多項(xiàng)GWAS研究中尚未發(fā)現(xiàn)上述基因與非綜合征型唇腭裂存在關(guān)聯(lián)。為了探討中國(guó)人群細(xì)胞黏附相關(guān)基因多態(tài)性與NSCL/P之間的關(guān)系，本研究在806個(gè)中國(guó)人群核心家庭中，對(duì)8個(gè)細(xì)胞黏附相關(guān)基因的226個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析和基因-環(huán)境交互作用分析。

1資料與方法

1.1研究人群

研究人群來自“唇腭裂基因和交互作用的國(guó)際合作研究”項(xiàng)目，該項(xiàng)目是一項(xiàng)有關(guān)非綜合征型唇腭裂的GWAS，其研究設(shè)計(jì)參見Beaty等[3]研究。本研究是在此GWAS基礎(chǔ)上進(jìn)行的中國(guó)人群數(shù)據(jù)的再次分析，研究對(duì)象包括在中國(guó)臺(tái)灣、山東、武漢、四川4個(gè)地區(qū)募集的806個(gè)NSCL/P核心家庭，共2 418人，具體信息參見王蘋等[14]研究。核心家庭指1個(gè)患者及其父母雙親?；颊哂膳R床遺傳學(xué)家或有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師確定病理類型，排除所有綜合征型患者。所研究患兒的父母均簽署知情同意書，原始研究獲得美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞黏附基因

本研究共納入8個(gè)細(xì)胞黏附相關(guān)基因，分別為CDH1、CTNNB1、PVRL1、PVRL2、PVRL3、ACTN1、VCL、LEF1。在細(xì)胞間的黏著連接中，鈣黏素為細(xì)胞黏附分子，捆綁著β-連環(huán)蛋白，β-連環(huán)蛋白與α-連環(huán)蛋白相連，α連環(huán)蛋白與F-肌動(dòng)蛋白相連，以上多種蛋白組成鈣黏素-肌動(dòng)蛋白復(fù)合物。鈣黏素-肌動(dòng)蛋白復(fù)合物的完整性影響著細(xì)胞間黏附、細(xì)胞遷移及β-連環(huán)蛋白的信號(hào)水平。細(xì)胞黏附過程在胚胎發(fā)育時(shí)期十分重要，在胚胎發(fā)育時(shí)期細(xì)胞黏附功能受到抑制可能引起唇腭裂的發(fā)生。細(xì)胞黏附分子及其編碼基因間的關(guān)系如圖1，圖中豎線代表細(xì)胞膜，方框內(nèi)為細(xì)胞黏附分子及其編碼基因(來源于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG. http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko04520+K05689)。

PVRL1, poliovirus receptor-related 1; PVRL2, poliovirus receptor-related 2; PVRL3, poliovirus receptor-related 3;CDH1, cadherin 1; ACTN1, actinin alpha 1; VCL, vinculin; CTNNB1, catenin beta 1; LEF1, lymphoid enhance-binding factor 1.圖1　細(xì)胞黏附分子及其編碼基因分布情況Figure 1　The distribution of cell adhesion molecules

1.3數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

本研究的基因型測(cè)定工作在美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院McKusick-Nathans遺傳醫(yī)學(xué)研究所遺傳病研究中心完成，所得位點(diǎn)信息通過統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制?？刂茦?biāo)準(zhǔn)為：(1)基因型的缺失率≤10%；(2)弱勢(shì)等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)≥1%；(3)孟德爾遺傳錯(cuò)誤≤5%；(4)父母人群處在Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，共有226個(gè)SNPs納入分析(表1)。

表1　細(xì)胞黏附相關(guān)基因基本信息

SNPs, single nucleotide polymorphisms.

1.4環(huán)境暴露因素

吸煙、飲酒及服用維生素補(bǔ)充劑的定義為患兒母親在孕前3個(gè)月至孕期最初3個(gè)月內(nèi)主動(dòng)吸食煙草、飲酒及服用維生素補(bǔ)充劑,被動(dòng)吸煙定義為患兒母親在孕前3個(gè)月及整個(gè)孕期內(nèi)在家中、工作場(chǎng)所或其他環(huán)境中有人在其周圍吸煙,以上環(huán)境暴露因素信息均通過面對(duì)面訪問獲得。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1.5.1關(guān)聯(lián)分析本研究采用核心家庭設(shè)計(jì)，通過傳遞不平衡檢驗(yàn)(transmisssion diseqilibrium test, TDT)[15]分析候選基因中SNP與疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。該方法通過收集父母和患病子女的基因型信息，評(píng)價(jià)單個(gè)位點(diǎn)上雜合子雙親在傳遞變異等位基因給子女時(shí)是否偏離期望傳遞率。拒絕無效假設(shè)提示該遺傳標(biāo)記位點(diǎn)與潛在疾病位點(diǎn)間連鎖且兩者處于連鎖不平衡狀態(tài)。傳遞不平衡檢驗(yàn)使用的軟件為Plink 1.07。

1.5.2交互作用分析利用Cordell法[16]患兒基因型為病例組，根據(jù)每一個(gè)核心家庭中父母與患兒的基因型，將未傳遞給子代的基因型構(gòu)建成虛擬同胞對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，與患兒基因型組成1∶3匹配的病例對(duì)照樣本，在加性遺傳模型假設(shè)下建立條件Logistic回歸模型，對(duì)常染色體上的位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)。建立的模型為模型1： logit[P|(casei)]=βG(Gi)+βG×E(Gi×Ei)，G=0,1,2代表患兒基因型中的弱勢(shì)等位基因個(gè)數(shù)，而E=0或1分別代表患兒母親未暴露或暴露于環(huán)境因素。應(yīng)用似然比檢驗(yàn)(likelihood ratio test, LRT)對(duì)該模型的偏回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。將模型1與模型2： logit[P|(casei)]=βG(Gi)，G=0,1,2進(jìn)行比較，可得自由度為1的似然比統(tǒng)計(jì)量及P值，代表對(duì)G×E交互作用項(xiàng)的檢驗(yàn)。拒絕無效假設(shè)，提示模型中位點(diǎn)與環(huán)境暴露因素之間的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此時(shí)OR(CL/P|G no E)=exp(βG)，代表母親沒有該環(huán)境暴露的情況下攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值。OR(CL/P|G and E)=exp(βG+βG×E)代表母親暴露于當(dāng)前的環(huán)境因素情況下攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值。模型1與無效假設(shè)模型進(jìn)行比較，可得到自由度為2的似然比統(tǒng)計(jì)量及P值，拒絕無效假設(shè)，說明考慮基因-環(huán)境交互作用后，模型中的位點(diǎn)多態(tài)性與疾病之間的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。交互作用分析采用R 2.15.2的Trio軟件包，與傳統(tǒng)的等位基因TDT相比，Trio軟件包可以估計(jì)不同基因型的OR值及基因-環(huán)境交互作用。

1.5.3多重檢驗(yàn)的校正 對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行Bonferroni校正，該校正方法為用顯著性水平除以比較的次數(shù)來調(diào)整P值。本次分析包含226個(gè)SNP，傳遞不平衡檢驗(yàn)與每個(gè)環(huán)境暴露因素的基因-環(huán)境交互作用分析的比較次數(shù)均為226次，因此設(shè)定顯著性P值為0.05/226，即當(dāng)P<0.000 2認(rèn)為該SNP的傳遞不平衡檢驗(yàn)或交互作用檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)基本情況

本研究中男性患兒占66.9%(539/806)，NSCL/P患兒中，單純唇裂(cleft lip, CL)為25.9%(209/806)，唇裂合并腭裂(cleft lip with cleft palate, CLP)占74.1%(597/806)。排除缺失數(shù)據(jù)后，本研究患兒母親的孕期被動(dòng)吸煙率為40.9%(324/793)，孕期補(bǔ)充多種維生素暴露率為12.9%(84/652)，而孕期吸煙及飲酒的暴露率均不足5%，因此本研究?jī)H對(duì)孕期被動(dòng)吸煙及孕期補(bǔ)充多種維生素進(jìn)行基因-環(huán)境交互作用分析。

2.2TDT檢驗(yàn)

對(duì)以上8個(gè)基因的226個(gè)SNPs進(jìn)行TDT檢驗(yàn)，其中23個(gè)SNPs與NSCL/P的TDT檢驗(yàn)的P值小于0.05。但經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后，所有SNPs的TDT檢驗(yàn)結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.000 2)。

2.3基因-環(huán)境交互作用

自由度為1和2時(shí)交互作用分析所得的P值均小于0.05的前5位SNPs見表2，進(jìn)行Bonferroni多重檢驗(yàn)校正后，ACTN1基因的rs743127位點(diǎn)與被動(dòng)吸煙的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 2)。OR(case|G no E)為母親孕期無被動(dòng)吸煙時(shí)攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值為0.59(95%CI:0.38～0.90)，OR(case|G and E)為患兒母親孕期中有被動(dòng)吸煙情況時(shí)攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的患兒的OR值為2.00(95%CI:1.23～3.26)。而基因-環(huán)境交互作用結(jié)果中P值較小的其他結(jié)果，如ACTN1基因的rs1475034、rs370535、rs2273419位點(diǎn),CTNNB1基因的rs106871位點(diǎn)與被動(dòng)吸煙(圖2)和PVRL3基因的rs7634000、rs2971366、rs2634553、rs1489032、rs7624812位點(diǎn)與母親孕期補(bǔ)充維生素(圖3)的交互作用的P值并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.000 2)。

3討論

本研究針對(duì)806個(gè)中國(guó)漢族NSCL/P核心家庭，選取了細(xì)胞黏附相關(guān)8個(gè)基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析及基因-環(huán)境交互作用分析，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Bonferroni校正后，細(xì)胞黏附相關(guān)基因與NSCL/P之間的關(guān)聯(lián)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而基因-環(huán)境交互作用分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)過校正后，ACTN1基因上的rs743127與被動(dòng)吸煙之間的交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患兒母親孕期有被動(dòng)吸煙時(shí)攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的OR值大于母親孕期無被動(dòng)吸煙時(shí)攜帶一個(gè)危險(xiǎn)位點(diǎn)的OR值，因此說明母親孕期被動(dòng)吸煙可增加子代患NSCL/P的風(fēng)險(xiǎn)。

ACTN1位于染色體14q24區(qū)域，ACTN1是角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的α輔肌動(dòng)蛋白中的一個(gè)亞系。當(dāng)角質(zhì)細(xì)胞缺乏ACTN1的表達(dá)時(shí)，會(huì)改變細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)成，改變細(xì)胞極性，影響細(xì)胞偽足的運(yùn)動(dòng)性[17]。有研究表明，ACTN1基因突變與先天性巨血小板減少癥有關(guān)，可能的機(jī)制為ACTN1通過影響α-輔肌動(dòng)蛋白的形成而導(dǎo)致異常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[18]。本研究結(jié)果表明,ACTN1基因上的rs743127位點(diǎn)與被動(dòng)吸煙的交互作用可能影響NSCL/P的發(fā)生，但目前沒有研究表明ACTN1與NSCL/P之間存在關(guān)聯(lián)。

有研究發(fā)現(xiàn)在攜帶CDH1基因突變的遺傳性彌漫性胃癌病人中唇裂或腭裂的發(fā)病率較高[19-20]，唇腭裂與癌癥發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)，說明唇腭裂與癌癥可能存在相同的病因，機(jī)制上可能是基因變異使細(xì)胞間黏附過程及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性受影響所致[21-22]。近年來，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)CDH1基因的rs16260、rs1801552位點(diǎn)與唇腭裂發(fā)生相關(guān)[5-7]。2014年，Bureau等[23]發(fā)現(xiàn)唇腭裂家族成員中CDH1存在罕見單核苷酸變異，以上研究結(jié)果表明CDH1基因可能影響唇腭裂的發(fā)生。PVRL1/2/3為脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因，分別位于染色體11q23.3，19q13，3p22.1區(qū)域，屬于免疫球蛋白超家族，參與上皮細(xì)胞的黏附過程，編碼黏連蛋白，其主要作用是協(xié)同鈣黏素調(diào)整上皮黏著連接形成的速度，影響上皮細(xì)胞的緊密連接形成[24]。研究表明，PVRL1在上腭的上皮細(xì)胞表達(dá)，且PVRL1基因突變參與綜合征型唇腭裂的發(fā)生[25]。PVRL1也是非綜合征型唇腭裂的候選基因，在委內(nèi)瑞拉、美國(guó)、菲律賓及丹麥等多個(gè)人群研究中PVRL1突變與非綜合征型唇腭裂存在相關(guān)[8-12]。然而，此結(jié)果并沒有在中國(guó)漢族人群及巴西人群中發(fā)現(xiàn)[26-28]。2014年研究發(fā)現(xiàn)土耳其人群中PVRL1基因中GGA片段的插入與非綜合征型唇腭裂有關(guān)[29]。

表2　基因-環(huán)境交互作用分析結(jié)果

SNP, single nucleotide polymorphism; MAF, minor allele frequency;LRT, likelihood ratio test; G, gene; E, environment.

圖2　在條件Logistic回歸模型中，考慮SNP效應(yīng)及與環(huán)境的交互作用后ACTN1和CTNNB1的SNP在未暴露和暴露于被動(dòng)吸煙的OR值，基因-環(huán)境交互作用的1個(gè)自由度和2個(gè)自由度的P值顯示在X軸Figure 2　SNP×environmental tobacco smoke. Estimated OR(case|G no E) and OR(case|G and E) from conditional Logistic regression model considering SNP effects and their interaction with maternal exposure to environmental tobacco smoke on 806 NSCL/P case-parent trios for five SNPs in ACTN1 and CTNNB1. P-values from the 2 df and 1 df LRT for G×E interaction are shown along the X axis

圖3　在條件Logistic回歸模型中，考慮SNP效應(yīng)及與環(huán)境的交互作用后PVRL3的SNP在孕期未補(bǔ)充維生素和補(bǔ)充維生素的OR值，基因-環(huán)境交互作用的1個(gè)自由度和2個(gè)自由度的P值顯示在X軸Figure 3　SNP × maternal multivitamin supplementation. Estimated OR (case|G no E) and OR (case|G and E) from conditional Logistic regression model considering SNP effects and their interaction with maternal exposure to multivitamin supplementation on 806 NSCL/P case-parent trios for five SNPs in PVRL3. P-values from the 2 df and 1 df LRT for G×E interaction are shown along the X axis

本研究并未發(fā)現(xiàn)CDH1及PVRL1/2/3與NSCL/P之間存在關(guān)聯(lián)可能由于以下幾個(gè)原因：本研究同時(shí)分析226個(gè)基因位點(diǎn)，位點(diǎn)數(shù)目多，在同一樣本中進(jìn)行的檢驗(yàn)次數(shù)也隨之增多，由于存在多重比較的問題，使得假陽性率升高，本次研究使用Bonferroni法進(jìn)行多重檢驗(yàn)的校正，該方法假設(shè)每次比較之間是相互獨(dú)立的，而基因位點(diǎn)之間是具有相關(guān)性的，因此使用該方法得出的結(jié)果比較保守；NSCL/P遺傳位點(diǎn)的異質(zhì)性、等位基因異質(zhì)性等也可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。不同的研究對(duì)環(huán)境因素暴露的定義和測(cè)量方法不一致、種族異質(zhì)性、樣本量大小不足等可能導(dǎo)致多項(xiàng)研究結(jié)果不一致。因此，在進(jìn)一步的研究中可以統(tǒng)一環(huán)境暴露的定義、擴(kuò)大樣本量或者聯(lián)合多項(xiàng)研究等方法探索基因-環(huán)境交互作用與NSCL/P的關(guān)聯(lián)。

本研究?jī)?yōu)勢(shì)為核心家庭設(shè)計(jì)可以較好地避免人群分層對(duì)研究造成的混雜,此種研究設(shè)計(jì)適用于早發(fā)疾病，可探索基因-環(huán)境交互作用。針對(duì)本病的發(fā)病率，此種設(shè)計(jì)類型把握度較高。但本次研究也具有如下的局限性,第一，核心家庭設(shè)計(jì)無法探索環(huán)境因素的獨(dú)立危險(xiǎn)效應(yīng)。第二，本研究是在GWAS基礎(chǔ)上進(jìn)行的數(shù)據(jù)二次分析，由于GWAS只關(guān)注MAF大于1%的常見遺傳變異位點(diǎn)，所以本次研究無法分析可能影響疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的罕見遺傳變異位點(diǎn)與NSCL/P的關(guān)聯(lián)。

研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附相關(guān)基因與唇腭裂的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，但多項(xiàng)獨(dú)立研究結(jié)果并不一致，可進(jìn)一步在不同人群中開展細(xì)胞黏附相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)研究、基因-基因及基因-環(huán)境交互作用分析。已有研究表明，CDH1基因的rs16260位點(diǎn)與單純腭裂存在相關(guān)[5]，但目前其他細(xì)胞黏附相關(guān)基因與單純腭裂之間的關(guān)系并不明確，因此可在中國(guó)單純腭裂患者中開展以上分析，更加深入地探索唇腭裂的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)測(cè)其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及制定預(yù)防措施提供科學(xué)證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Cooper ME, Ratay JS, Marazita ML. Asian oral-facial cleft birth prevalence[J]. Cleft Palate Craniofac J, 2006, 43(5): 580-589.

[2]Christensen K, Fogh-Andersen P. Cleft lip (±cleft palate) in Danish twins, 1970—1990[J].Am J Med Genet, 1993, 47(6): 910-916.

[3]Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4[J]. Nat Genet, 2010, 42(6): 525-529.

[4]Beaty TH, Taub MA, Scott A , et al. Confirming genes influencing risk to cleft lip with/without cleft palate in a case-parent trio study[J]. Hum Genet, 2013, 132(7): 771-781.

[5]Song Y, Zhang S. Association ofCDH1 promoter polymorphism and the risk of non-syndromic orofacial clefts in a Chinese Han population[J]. Arch Oral Biol, 2011, 56(1): 68-72.

[6]Rafighdoost H, Hashemi M, Narouei A, et al. Association betweenCDH1 andMSX1 gene polymorphisms and the risk of nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate in a southeast Iranian population[J]. Cleft Palate Craniofac J, 2013, 50(5): e98-e104.

[7]Hozyasz KK, Mostowska A, Wójcicki P, et al. Nucleotide variants of the cancer predisposing gene CDH1 and the risk of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Fam Cancer, 2014, 13(3): 415-421.

[8]S?zen MA, Suzuki K, Tolarova MM, et al. Mutation ofPVRL1 is associated with sporadic, non-syndromic cleft lip/palate in nor-thern Venezuela[J]. Nat Genet, 2001, 29(2): 141-142.

[9]Scapoli L, Palmieri A, Martinelli M, et al. Study of thePVRL1 gene in Italian nonsyndromic cleft lip patients with or without cleft palate[J]. Ann Hum Genet, 2006, 70(3): 410-413.

[10]Avila JR, Jezewski PA, Vieira AR, et al.PVRL1 variants contri-bute to non-syndromic cleft lip and palate in multiple populations[J]. Am J Med Genet A, 2006, 140(23): 2562-2570.

[11]Tongkobpetch S, Suphapeetiporn K, Siriwan P, et al. Study of the poliovirus receptor related-1 gene in Thai patients with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Int J Oral Ma-xillofac Surg, 2008, 37(6): 550-553.

[12]S?zen MA, Hecht JT, Spritz RA. Mutation analysis of thePVRL1 gene in caucasians with nonsyndromic cleft lip/palate[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2009, 13(5): 617-621.

[13]Stemmler MP, Bedzhov I. A Cdh1HA knock-in allele rescues the Cdh1-/-phenotype but shows essential Cdh1 function during pla-centation[J]. Dev Dyn, 2010, 239(9): 2330-2344.

[14]王蘋, 吳濤, 曹衛(wèi)華. 非綜合征型唇腭裂病因研究進(jìn)展[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 47(5): 466-469.

[15]Spielman RS, McGinnis RE, Ewenst WJ. Transmission test for linkage disequilibrium: The insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am J Hum Genet, 1993, 52(3): 506-516.

[16]Cordell HJ. Epistasis: what it means, what it doesn't mean, and statistical methods to detect it in humans. Hum Mol Genet, 2002, 11(20): 2463-2468.

[17]Hamill KJ, Hiroyasu S, Colburn ZT, et al. Alpha actinin-1 regulates cell-matrix adhesion organization in keratinocytes: consequences for skin cell motility[J]. J Invest Dermatol, 2015, 135(4): 1043-1052.

[18]Kunishima S, Okuno Y, Yoshida K, et al.ACTN1 mutations causecongenital macrothrombocytopenia[J]. Am J Hum Genet, 2013, 92(3): 431-438.

[19]Frebourg T, Oliveira C, Hochain P, et al. Cleft lip/palate andCDH1/E-cadherin mutations in families with hereditary diffuse gastric cancer[J]. J Med Genet, 2006, 43(2): 138-142.

[20]Kluijt I, Siemerink EJM, Ausems MGEM, et al.CDH1-related hereditary diffuse gastric cancer syndrome: Clinical variations and implications for counseling[J]. Int J Cancer, 2012, 131(2): 367-376.

[21]Taioli E, Ragin C, Robertson L, et al. Cleft lip and palate in family members of cancer survivors[J].Cancer Invest, 2010, 28(9): 958-962.

[22]Vieira AR, Khaliq S, Lace B. Risk of cancer in relatives of children born with isolated cleft lip and palate[J]. Am J Med Genet A, 2012, 158(6): 1503-1504.

[23]Bureau A, Parker MM, Ruczinski I, et al. Whole exome sequencing of distant relatives in multiplex families implicates rare variants in candidate genes for oral clefts[J]. Genetics, 2014, 197(3): 1039-1044.

[24]Honda T, Shimizu K, Fukuhara A, et al. Regulation by nectin of the velocity of the formation of adherens junctions and tight junctions[J].Biochem Biophys Res Commun, 2003, 306(1): 104-109.

[25]Suzuki K, Hu D, Bustos T, et al. Mutations ofPVRL1, encoding a cell-cell adhesion molecule/herpesvirus receptor, in cleft lip/palate-ectodermal dysplasia[J].Nat Genet, 2000, 25(4): 427-430.

[26]趙雄, 姜潤(rùn)松, 劉銳, 等. 江浙地區(qū)漢族人群非綜合征性唇腭裂與PVRL1 exon 3多態(tài)性的相關(guān)研究[J]. 中華整形外科雜志, 2009, 25 (1): 31-33.

[27]Cheng HQ, Huang EM, Xu MY, et al.PVRL1 as a candidate gene for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate: no evidence for the involvement of common or rare variants in southern han chinese patients[J]. DNA Cell Biol, 2012, 31(7): 1321-1327.

[28]Paranaíba LM, de Aquino SN, Bufalino A, et al. Contribution of polymorphisms in genes associated with craniofacial development to the risk of nonsyndromic cleft lip and/or palate in the Brazilian population[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2013, 18(3): e414-420.

[29]Aslar D, Tastan H. Novel insertion mutation in thePVRL1 gene in Turkish patients with non-syndromic cleft lip with/without cleft palate[J]. Arch Oral Biol, 2014, 59(3): 237-240.

(2016-02-22收稿)

(本文編輯：劉淑萍)

Association study between candidate genes involved in cell-cell adhesion and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese population

YUAN Yuan1, WANG Ping2, WU-CHOU Yah-huei3, YE Xiao-qian4,5, HUANG Shang-zhi6, SHI Bing7, WANG Ke8, WANG Zhu-qing1, LIU Dong-jing1, WANG Zi-fan9,WU Tao1△, WANG Hong1

(1.Department of Epidemiology and Biostatistics, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China; 2. Department of Statistics and Information, Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing 100013, China; 3. Department of Medical Research, Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taiwan 33305, China; 4. Department of Pe-diatric Dentistry, Wuhan University School of Stomatology, Wuhan 430079, China; 5. Mount Sinai Medical Center, New York 10029, USA; 6. Department of Medical Genetics, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China; 7. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, State Key Laboratory of Oral Disease, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 8.Department of Oral Surgery,Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong, China；9. Peking University School of Basic Medical Sciences, Beijing 100191, China)

ABSTRACTObjective： To explore the association and gene-environment interaction between single nucleotide polymorphisms (SNPs) involved in cell-cell adhesion and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P) among Chinese population. Methods: A total of 806 NSCL/P trios were drawn by an international consortium, which conducted a genome-wide association study (GWAS) using a case-parent trio design to investigate genes affecting risks to NSCL/P. The transmission disequilibrium test (TDT) was used to explore the association between cell-cell adhesion genes, including CDH1, CTNNB1, PVRL1, PVRL2, PVRL3, ACTN1, VCL, LEF1, and NSCL/P. Conditional Logistic regression models were used to estimate effects on risk of exposed and unexposed children. Four common maternal exposures including maternal smoking, environmental tobacco smoke, alcohol consumption and multivitamin supplementation during pregnancy were included in this study. Results: A total of 226 SNP markers were tested after quality control in this study. Although 23 SNPs in three genes (CTNNB1, CDH1, ACTN1) showed nominal significant association with NSCL/P in the TDT (P<0.05).There were no significant evidence of linkage and association that remained in the transmission disequilibrium test after Bonferroni correction(P>0.000 2). Tests for gene-environment interaction yielded significant results between rs743127 in ACTN1 and environmental tobacco smoke (P=0.000 1) with an estimated OR (case|G and E)=2.00(95%CI: 1.23-3.26) and OR (case|G no E)=0.59 (95%CI: 0.38-0.90). Among the lower P value results in gene-environment tests, there were no significant results between rs1475034, rs370535, rs2273419 in ACTN1, rs106871 in CTNNB1 and environmental tobacco smoke interaction. There were also no significant results between rs7634000, rs2971366, rs2634553, rs1489032, rs7624812 in PVRL3 and multivitamin supplementation during pregnancy in gene-environment tests(P>0.000 2). Conclusion: There is no association between cell-cell adhesion genes, including CDH1, CTNNB1, PVRL1, PVRL2, PVRL3, ACTN1, VCL, LEF1, and NSCL/P when the genes are considered alone. But our results suggest that SNPs in ACTN1 may influence the risk to NSCL/P through gene-environment interaction.

KEY WORDSACTN1; Cleft lip; Polymorphism, genetic; Genetic association studies; Gene-environment interaction

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81573225)資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (81573225)

Corresponding author△’s e-mail, twu@bjmu.edu.cn

[中圖分類號(hào)]R181.33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-167X(2016)03-0403-06

doi:10.3969/j.issn.1671-167X.2016.03.005

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-1213：25：36網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160512.1325.016.html