界面介質(zhì)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華，賈士儒

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津　300350；2.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　300457）

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界面介質(zhì)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響

湯衛(wèi)華1，賈士儒2

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350；2.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

摘要：為了提高靜置培養(yǎng)條件下木醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，考察在培養(yǎng)基中添加界面介質(zhì)（紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜）對(duì)細(xì)菌纖維素合成的影響。結(jié)果表明，聚氨酯薄膜材料的面積為培養(yǎng)基液面1/2時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量是對(duì)照組的1.51倍；同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些界面介質(zhì)提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的原因是主要副產(chǎn)物乙酸和葡萄糖酸的產(chǎn)量降低。這表明界面介質(zhì)能夠限制氧氣的傳遞，阻止葡萄糖氧化成為葡萄糖酸，使碳源流主要流向細(xì)菌纖維素合成途徑。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌纖維素；界面介質(zhì)；木醋桿菌；產(chǎn)量

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是某些細(xì)菌合成的高分子化合物，具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，雖然BC和植物或海藻產(chǎn)生的纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，但BC卻具有很多獨(dú)特的性質(zhì)，如高結(jié)晶度、高化學(xué)純度、高抗張強(qiáng)度、高彈性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可調(diào)控性等［1］，這些性質(zhì)是其他來(lái)源纖維無(wú)法比擬的。

雖然BC的發(fā)現(xiàn)至今已有100多年的歷史，但由于生產(chǎn)成本高，以至其應(yīng)用受到限制。為了提高BC的產(chǎn)量，除了很多學(xué)者在菌種選育、發(fā)酵工藝、發(fā)酵裝置等方面進(jìn)行了大量研究以外，有學(xué)者在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下添加增稠劑，如海藻酸鈉［2］、瓊脂［3-4］、明膠和Polyacry Lamide-coacrylic acid（PCA）［5］來(lái)提高BC的產(chǎn)量。E J Vandamme發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入一些不溶于水的小顆粒物質(zhì)（沙子、硅藻土或者玻璃球等），可阻止葡萄糖變成葡萄糖酸，提高BC產(chǎn)率。而在靜置培養(yǎng)條件下，添加這些物質(zhì)對(duì)細(xì)菌纖維素膜合成的影響探討較少。基于在靜置培養(yǎng)條件下得到的細(xì)菌纖維素膜具有良好的成膜性，能更好地應(yīng)用于一些對(duì)成膜性要求較高的領(lǐng)域，如醫(yī)用行業(yè)、膜材料等。為了提高靜置培養(yǎng)條件下BC的產(chǎn)量，在前期培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究界面介質(zhì)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響，并且初步探討其機(jī)理。

1　試驗(yàn)材料和方法

1.1菌種

木醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus），天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

1.2.1培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨5，酵母粉5，檸檬酸1，葡萄糖20，Na2HPO45，pH值6.0。于121℃條件下滅菌20 min；固體培養(yǎng)基（g/L）：同上，瓊脂20。

1.2.2培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取1環(huán)活化好的斜面種子接入液體培養(yǎng)基，于30℃條件下振蕩培養(yǎng)24～30 h，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，作為種子。

1.3分析方法

1.3.1細(xì)菌纖維素提取和處理方法

培養(yǎng)結(jié)束后將膜取出，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，于100℃條件下煮沸20 min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測(cè)pH值，約7.2。80℃干燥至恒質(zhì)量，進(jìn)行稱質(zhì)量。纖維素的產(chǎn)量表示為纖維素（g）/培養(yǎng)基（L）。

1.3.2菌體量的測(cè)定

用0.85%的生理鹽水配制pH值為4.6～4.8的0.1 mol/L醋酸鉀-醋酸緩沖溶液100 mL，取纖維素酶2 g放入緩沖溶液中活化，置冰箱備用。測(cè)定時(shí)，每次取活化好的纖維素酶溶液2 mL在50℃，pH值為5.0條件下充分水解2 h，適當(dāng)稀釋后，于600 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度OD600值。

1.3.3葡萄糖酸和乙酸的測(cè)定

葡萄糖酸和乙酸使用HPLC檢測(cè)［6］，采用C18型反相柱（250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為0.05 mol/L KH2PO4；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1不同的界面介質(zhì)對(duì)BC產(chǎn)量的影響

選取不溶于水的、可高溫滅菌且可反復(fù)利用的外源介質(zhì)（如紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜材料），平放于培養(yǎng)皿中濕熱滅菌備用。接種量為6%（V/V），培養(yǎng)時(shí)間為6 d，考察這些不同來(lái)源的界面介質(zhì)對(duì)木醋桿菌生物合成細(xì)菌纖維素的影響。

培養(yǎng)基中添加不同的界面介質(zhì)對(duì)BC產(chǎn)量以及菌體生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

圖1　培養(yǎng)基中添加不同的界面介質(zhì)對(duì)BC產(chǎn)量以及菌體生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，不同來(lái)源的介質(zhì)均能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和細(xì)菌纖維素的生物合成，可能這些介質(zhì)為木醋桿菌的生長(zhǎng)提供了良好的生長(zhǎng)界面，因此促進(jìn)了菌體的大量生長(zhǎng)，繼而生物合成更多的細(xì)菌纖維素。其中，聚氨酯薄膜對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響最大，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到5.63 g/L，是對(duì)照組的1.32倍；其次為玻璃紙薄膜、濾布和紗布。

2.2界面介質(zhì)面積對(duì)BC產(chǎn)量的影響

在直徑90 mm的平皿中分別放入直徑為90 mm（63.6 cm2即平皿面積）、64 mm（31.8 cm2即平皿面積的1/2）和22.5 mm（15.9 cm2即平皿面積的1/4）的聚氨酯薄膜，考察不同的聚氨酯薄膜面積對(duì)BC生物合成和菌體生長(zhǎng)的影響。

不同的介質(zhì)面積對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和菌體量的影響見(jiàn)表1。

表1　不同的介質(zhì)面積對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量和菌體量的影響

由表1可知，介質(zhì)的面積對(duì)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量和菌體量都有影響，其中直徑為64 mm的介質(zhì)，即介質(zhì)面積為整個(gè)培養(yǎng)液面面積的1/2時(shí)，BC產(chǎn)量最高，達(dá)到5.79 g/L，是對(duì)照組的1.51倍；其次是直徑為90 mm的介質(zhì)，其BC產(chǎn)量為5.31 g/L；最后是直徑為22.5 mm的介質(zhì)，其BC產(chǎn)量為4.48 g/L。不同的介質(zhì)面積對(duì)BC產(chǎn)量影響較大的原因，可能是一方面介質(zhì)為木醋桿菌的生長(zhǎng)提供良好的生長(zhǎng)面，同時(shí)這些介質(zhì)又會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞。當(dāng)介質(zhì)面積為31.8 cm2時(shí)，既能為菌體生長(zhǎng)提供良好的附著面，又能供給菌體生長(zhǎng)需要的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此促進(jìn)細(xì)菌纖維素的生物合成和菌體的大量生長(zhǎng)。

2.3機(jī)理分析

研究發(fā)現(xiàn)，加入直徑為64 mm的聚氨酯薄膜材料后，對(duì)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用。在原有培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，添加聚氨酯薄膜材料后，考察這些因素對(duì)木醋桿菌主要代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。

木醋桿菌代謝產(chǎn)物分析見(jiàn)表2。

由表2可知，在培養(yǎng)基中加入聚氨酯薄膜后，對(duì)木醋桿菌代謝途徑有明顯的影響，副產(chǎn)物乙酸和葡萄糖酸的產(chǎn)量下降。這可能是培養(yǎng)基中添加這些非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)后，能夠限制氧氣的傳遞，使葡萄糖酸的生物合成下降，使更多的碳源用于BC的生物合成和菌體的生長(zhǎng)。

表2　木醋桿菌代謝產(chǎn)物分析

3　結(jié)論

培養(yǎng)基中放置紗布、濾布、聚氨酯薄膜和玻璃紙薄膜后，均能明顯地提高BC產(chǎn)量，其中聚氨酯薄膜的效果更佳。聚氨酯薄膜的面積為培養(yǎng)基液面1/2時(shí)，BC產(chǎn)量達(dá)最高，是對(duì)照組的1.51倍。究其原因，是由于這些界面介質(zhì)能夠限制氧氣的傳遞，阻止葡萄糖氧化成為葡萄糖酸，使碳源流主要流向BC合成途徑，因此BC產(chǎn)量大幅度提高。

參考文獻(xiàn)：

［1］湯衛(wèi)華，李飛，賈媛媛，等.細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株的誘變選育和發(fā)酵條件的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009（9）：1 016-1 019.

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Effect of Media Interface on the Production of Bacterial Cellulose from Acetobacter Xylinum

TANG Weihua1，JIA Shiru2
（1.Department of Chemical Biology，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Industrial Microbiology Key Laboratory，Tianjin 300457，China）

Abstract：In order to improve the production of bacterial cellulose fermentation on the static culture，several media interfaces such as gauze，filter cloth，polyurethane film and cellophane film are appended in substrate.The effect of media interface on the production of bacterial cellulose from Acetobacter xylinum is investigated.The results show that the yield of bacterial cellulose is 1.51 times higher than the control group when the area of the polyurethane film is half of the medium liquid level. At the same time，it is found that the increase of the yield of bacterial cellulose is mainly due to the decrease of the yield of acetic acid and glucose.This indicates that the interface medium can restrict the transfer of oxygen，prevent oxidation of glucose into glucose acid，so that more carbon source flow to bacterial cellulose biosynthesis.

Key words：bacterial cellulose；media interface；Acetobacter xylinum；yield

中圖分類號(hào)：TQ352.4；Q933

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.05.043

文章編號(hào)：1671-9646（2016）05b-0052-02

收稿日期：2016-04-01

作者簡(jiǎn)介：湯衛(wèi)華（1979—），女，博士，教授，研究方向?yàn)樯锘ぁ?/p>