人參親環(huán)素蛋白原核表達(dá)及其抗真菌活性

李帥軍，才可新，張楠楠，孫天霞，趙　雨，曲　毅,2*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長(zhǎng)春 130117;2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)春 130033)

人參親環(huán)素蛋白原核表達(dá)及其抗真菌活性

李帥軍1，才可新1，張楠楠1，孫天霞1，趙雨1，曲毅1,2*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，長(zhǎng)春 130117;2.吉林省食品藥品安全監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)春 130033)

摘要：目的研究人參親環(huán)素蛋白(pgCyP)體外抗真菌活性。方法采用RT-PCR技術(shù),擴(kuò)增人參cyclophilin(pgCyP)基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，通過親和純化獲得pgCyP蛋白，紙片擴(kuò)散法驗(yàn)證目的蛋白的抗菌活性。結(jié)果人參CyP基因全長(zhǎng)為522個(gè)堿基,編碼174個(gè)氨基酸；目的蛋白經(jīng)純化后,SDS-PAGE分析顯示單一條帶;抑菌試驗(yàn)表明該重組蛋白可明顯抑制疫霉菌菌絲的生長(zhǎng)。結(jié)論成功克隆并表達(dá)具有抗菌活性的pgCyP蛋白,為進(jìn)一步研究pgCyP在人參抗真菌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：親環(huán)素；人參；原核表達(dá)；純化；抗真菌活性

目前，人們已經(jīng)從植物中分離出了許多抗菌蛋白如幾丁質(zhì)、親環(huán)素、防御素凝集素和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白等[1-6]。親環(huán)素(CyP)是一類免疫因子，可以和免疫抑制劑環(huán)孢素A特異性結(jié)合[7]，廣泛存在于各種生物體，具有PPIase活性，能催化Xaa-Pro肽鍵異構(gòu)化，在多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[8]。目前已發(fā)現(xiàn)親環(huán)素對(duì)多種真菌具有抑制能力，許多親環(huán)素類抗真菌蛋白已經(jīng)從黑臍豆、綠豆、白菜和鷹嘴豆等植物中鑒定獲得[9-11]。本研究通過構(gòu)建人參親環(huán)素原核表達(dá)載體，并針對(duì)目的蛋白進(jìn)行抗疫霉菌生物活性研究，為今后人參抗病害研究提供技術(shù)支撐。

1材料

1.1材料5年生人參(PanaxginsengC.A Meyer)樣品采自吉林省撫松縣人參種植產(chǎn)業(yè)基地；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)本實(shí)驗(yàn)室保存；人參疫病(Phytophthora cactorum)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院韓梅教授提供并鑒定；載體pGEX-6p-1由吉林大學(xué)生命科學(xué)院提供；Ni-chelating sepharose FF購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2試劑T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Not I、RT-PCR試劑盒購(gòu)自TakaRa生物工程(大連)有限公司。

2方法

2.1人參CyP原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)人參CyP(pgCyP)基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物上游5’- CGGATCCATGGCCAACCCAA-3 ’，下游引物5’- ATT

TGCGGCCGCGTGGTG，GTGGTGGTGGTGCTCGAG-3’，PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段連接到pMDTM18-T并進(jìn)行測(cè)序，BamH I和Not I雙酶切，將目的基因連接到表達(dá)載體pGEX-6p-1，獲得重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-pgCyP，質(zhì)粒鑒定后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)。

2.2誘導(dǎo)表達(dá)將陽(yáng)性克隆菌株接種到20 mL LB(Ampicillin)培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩過夜，然后按1%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至100 mL LB(Ampicillin)培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃，200 r/min振蕩誘導(dǎo)5 h，離心取沉淀。分別對(duì)誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后菌沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2.3蛋白純化誘導(dǎo)后菌離心，取沉淀重懸于Wash Buffer，4 ℃低溫離心后，沉淀重懸于Lysis Buffer，加入適量的DNase I( 濃度為2 000 U/mL )冰浴超聲30 min。將菌體裂解液以10 000×g，4 ℃離心20 min。棄上清收集包涵體并使用變性劑溶解；透析復(fù)性后，包涵體溶解液上清用0.2 μM濾膜過濾，Ni-chelating sepharose FF親和層析柱純化蛋白，用含100、500 mmol/L咪唑的Elution Buffer分別洗脫蛋白，收集洗脫流穿峰，最后用SephadexG-25 除鹽柱脫鹽處理，采用Bradford方法測(cè)定目的蛋白濃度。

2.4體外抗菌活性實(shí)驗(yàn)將疫霉菌接種在PDB培養(yǎng)液中，28 ℃培養(yǎng)3 d后，用121 ℃高溫滅菌的8層紗布收集真菌孢子液，取經(jīng)滅菌水稀釋至一定濃度的孢子液80 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中，后在孔中加20 μL一定濃度的蛋白溶液，以加入GST載體蛋白和緩沖液為對(duì)照，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌液OD值繪制生長(zhǎng)曲線，判斷真菌對(duì)pgCyP蛋白的敏感程度。

3結(jié)果

3.1pgCyP原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果表明，基因全長(zhǎng)522 bp，編碼174個(gè)氨基酸?；蚱芜B入pGEX-6P-1載體并擴(kuò)增，質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Not I雙酶切鑒定，獲得約520 bp和4.9 kb兩條帶(見圖1)，大小與目的片段和載體片段相符。

3.2誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果表明，在約46 kDa處有明顯的條帶(圖2泳道3)，而且以包涵體形式高表達(dá)(圖2泳道5)。結(jié)果符合預(yù)期。經(jīng)Ni親和層析純化后，獲得了純度較高的重組蛋白(圖2 泳道9)。

3.3蛋白對(duì)真菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白對(duì)疫霉菌具有明顯的抑制作用，半抑制率的濃度為2.55 μmol/L。

1 DNA Maker　2 質(zhì)粒pGEX-6p-1-pgCyP雙酶切圖1　質(zhì)粒酶切鑒定

1 Pr Maker　2 pGEX-6P-1　3 誘導(dǎo)菌體　4 菌體裂解上清5 菌體裂解沉淀　6 包涵體溶解液　7 蛋白循環(huán)上樣后8 蛋白純化后流穿　9 純化后洗脫收集液圖2　蛋白表達(dá)純化

4小結(jié)

本課題組在前期工作中已應(yīng)用Illumina Hiseq-2000高通量測(cè)序技術(shù)建立了人參葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)了一條cDNA序列為親環(huán)素基因，并且該基因的轉(zhuǎn)錄水平與人參易患病時(shí)期密切相關(guān)。推測(cè)人參親環(huán)素在人參患病時(shí)期高表達(dá)，很可能是一種抗真菌蛋白。實(shí)驗(yàn)中得到了人參親環(huán)素的全長(zhǎng)基因，對(duì)于今后從基因表達(dá)水平方面研究親環(huán)素基因在人參的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝過程中的作用具有重要意義。利用pGEX-6P-1作為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了人參親環(huán)素原核表達(dá)體系，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了融合蛋白表達(dá)。在插入片段C端插入6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，為下游分離純化親環(huán)素蛋白提供了良好條件。純化的重組蛋白也為未來制備人參親環(huán)素抗體提供了實(shí)驗(yàn)材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]T.KAWASE,S.YOKOKAWA,A.SAITO,et al.Comparison of enzymatic and antifungal properties between family 18 and 19 chitinases from S.coelicolor A3(2)[J].Biosci Biotechnol Biochem,2006,70(4):988-998.

[2]N.SATTAYASAI,R.SUDMOON,S.NUCHADOMRONG,et al.W.Bunyatratchata,Dendrobium findleyanum agglutinin:production,localization,anti-fungal activity and gene characterization[J].Plant Cell Rep,2009,28(8):1243-1252.

[3]J.H.WONG,T.B.Ng,Sesquin,A potent defensin-like antimicrobial peptide from ground beans with inhibitory activities toward tumor cells and HIV-1 reverse transcriptase[J].Peptides,2005,26(7):1120-1126.

[4]X.Y.YE,T.B.Ng,Isolation of unguilin,a cyclophilin-like protein with anti-mitogenic,antiviral,and antifungal activities,from black-eyed pea[J].J Protein Chem,2001,20(5):353-359.

[5]P.LIN,L.XIA,T.B.Ng,First isolation of an antifungal lipid transfer peptide from seeds of a Brassica species[J].Peptides,2007,28(8):1514-159.

[6]S.Y.WANG,Y.S.GONG,J.J.Zhou,Chromatographic isolation and characterization of a novel peroxidase from large lima legumes[J].J Food Sci,2009,74(3):C193-198.

[7]戴映,張晶,林美欽,等.環(huán)孢素A的藥物基因組學(xué)與個(gè)體化用藥的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2014,19(8):931-936.

[8]BARIK S.Immunophilins:for the love of proteins[J].Cell Mol Life Sci,2006,63:2889-2900.

[9]K.SEKHAR,B.PRIYANKA,V.D.REDDY,et al.Isolation and characterization of a pigeonpea cyclophilin (CcCYP) gene,and its over-expression in Arabidopsis confers multiple abiotic stress tolerance[J].Plant Cell Environ,2010,33(8):1324-1338.

[10]J.R.LEE,S.C.PARK,J.Y.KIM,et al.Molecular and functional characterization of a cyclophilin with antifungal activity from Chinese cabbage[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,353(3):672-678.

[11]X.Y.YE,T.B.Ng,Isolation of a new cyclophilin-like protein from chickpeas with mitogenic,antifungal and anti-HIV-1 reverse transcriptase activities[J].Life Sci,2002,70(10):1129-1138.

Prokaryotic expression of ginseng cyclophilin and the detected of antifungal activity

LI Shuaijun1,CAI Kexin1,ZHANG Nannan1,SUN Tianxia1,ZHAO Yu1,QU Yi1,2*

(1.Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center,Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Jilin Changchun 130117,China;2.Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug,Changchun 130033,China)

Abstract：ObjectiveWe investigated the antifungal activity of panax ginseng cyclophilin (pgCyP) in vitro.MethodsIn this study,we amplified pgCyP gene by RT-PCR,constructed prokaryotic expression plasmid and transformed into E.Coli.Target protein was induced by IPTG and affinity purified.Disc diffusion method was used to verify the antifungal activity of target protein.ResultsThe full length of pgCyP gene is 522 bp,which codes for a protein 174 amino acids in length.After purified,the target protein showed a single band in SDS-PAGE.Antifungal test showed that the recombinant protein can obviously inhibit the growth of the Phytophthora cactorum.ConclusionpgCyP was successfully cloned,expressed and antifungal activity characterization,which provides foundation for further research of pgCyP antifungal mechanism.

Keywords：Cyclophilin;Panax ginseng;prokaryotic expression;purification;antifungal activity

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.009

基金項(xiàng)目：吉林省經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專項(xiàng)項(xiàng)目(2014N155)。

作者簡(jiǎn)介：李帥軍(1987-),男,碩士研究生,主要從事中藥學(xué)研究。

*通信作者：曲毅,女，博士，助理研究員，電話-(0431)86172300，電子信箱-quyi1229@163.com

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2016)03-0464-03

收稿日期:(本欄責(zé)任編輯：張海洋2016-03-21)