力經(jīng)PSGL-1介導(dǎo)ERM蛋白ITAM-like序列上磷酸化位點(diǎn)的暴露*

吳建華　鄺曉敏　劉文平　方穎

(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

力經(jīng)PSGL-1介導(dǎo)ERM蛋白ITAM-like序列上磷酸化位點(diǎn)的暴露*

吳建華鄺曉敏劉文平方穎

(華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

摘要：炎癥反應(yīng)階段,P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)與埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)的結(jié)合在招募脾酪氨酸激酶(Syk)并促進(jìn)白細(xì)胞激活中發(fā)揮了重要作用.文中通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，位于ERM蛋白非傳統(tǒng)的免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM-like)上的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)(Y191和Y205)周圍存在較大的空間位阻,這將阻礙其被Src家族激酶酪氨酸磷酸化繼而招募Syk的過(guò)程.文中用拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法模擬力學(xué)環(huán)境下PSGL-1與根蛋白FERM結(jié)構(gòu)域的相互作用,構(gòu)象分析和殘基溶劑可及表面積的變化都表明，經(jīng)由PSGL-1傳導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)可以介導(dǎo)根蛋白ITAM-like序列上磷酸化位點(diǎn)Y205的暴露.文中結(jié)果揭示了一條經(jīng)由PSGL-1胞內(nèi)域激活Syk的力學(xué)信號(hào)通路,并且在原子層面上對(duì)PSGL-1/ERM/Syk之間的相互作用給予了闡釋.

關(guān)鍵詞：PSGL-1；ERM蛋白；Syk；ITAM-like序列；拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬

炎癥反應(yīng)過(guò)程中,選擇素通過(guò)與P-選擇素糖蛋白配體1 (PSGL-1)的結(jié)合介導(dǎo)了白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的初始拴縛和快速滾動(dòng)[1-2].白細(xì)胞滾動(dòng)過(guò)程中,選擇素與PSGL-1的結(jié)合會(huì)引起胞內(nèi)一系列信號(hào)的傳導(dǎo),包括脾酪氨酸激酶(Syk)的招募和磷酸化[3- 4],繼而把信號(hào)傳遞到下游分子并誘導(dǎo)整合素構(gòu)象伸長(zhǎng)從而將其激活,促使白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的緩慢滾動(dòng),最終徹底激活白細(xì)胞使其發(fā)揮免疫學(xué)功能[5-7].

作為整合素激活和白細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要分子[8-9],Syk通常被免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM,YxxI/Lx(6-12)YxxI/L)活化,即通過(guò)其雙重Src同源區(qū)2 (SH2 )結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化的ITAM相結(jié)合而激活[6,8],所以ITAM序列磷酸化位點(diǎn)的暴露并磷酸化對(duì)于Syk的活化至關(guān)重要.而一些非傳統(tǒng)的ITAM序列(ITAM-like序列)也陸續(xù)被證實(shí)與傳統(tǒng)的ITAM序列有著相似的功能,并且在某些情況下單個(gè)酪氨酸殘基就足以引起Syk的招募[10-11].

研究表明,在血流環(huán)境中白細(xì)胞的緩慢滾動(dòng)需要PSGL-1的胞內(nèi)域[7-8],PSGL-1胞內(nèi)域能夠通過(guò)埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)家族的ITAM-like序列與Syk結(jié)合并介導(dǎo)其激活[3,12].ERM蛋白作為橋梁分子，能夠把細(xì)胞膜上整合膜蛋白與細(xì)胞骨架之肌動(dòng)蛋白連接在一起,通過(guò)介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與細(xì)胞質(zhì)膜的連接調(diào)控信號(hào)分子的傳導(dǎo)[13].

鑒于PSGL-1與ERM蛋白的結(jié)合在招募Syk并促進(jìn)整合素和白細(xì)胞激活中發(fā)揮的重要作用,Takai等[14]在2007年結(jié)晶出了鼠源的PSGL-1胞內(nèi)域近膜端與根蛋白FERM結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),并從原子水平上對(duì)于二者之間的相互作用進(jìn)行了分析.根蛋白的ITAM-like序列位于FERM結(jié)構(gòu)域中,并且包含了結(jié)合Syk分子的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Y191和Y205.

但是通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)的分析筆者發(fā)現(xiàn),根蛋白上的ITAM-like序列周圍存在較大的空間位阻,尤其兩個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)Y191和Y205更是被包埋在蛋白里面,這將嚴(yán)重阻礙Y191和Y205的磷酸化過(guò)程,從而阻礙ITAM-like序列對(duì)Syk的招募,所以外界擾動(dòng)導(dǎo)致的構(gòu)象改變是必須的.

目前愈來(lái)愈多的證據(jù)表明，白細(xì)胞所處血流環(huán)境中的流體剪切力是一種非常重要的物理信號(hào),與化學(xué)信號(hào)一起在白細(xì)胞激活過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[15-17]；但力學(xué)信號(hào)與化學(xué)信號(hào)耦合并調(diào)控下游信號(hào)通路的機(jī)理至今尚未清晰.這里,筆者猜測(cè)由PSGL-1胞內(nèi)域傳導(dǎo)的力學(xué)信號(hào)可能激發(fā)其近膜端所連接的ERM蛋白上ITAM-like序列的打開(kāi),為后續(xù)的磷酸化和招募Syk提供結(jié)構(gòu)構(gòu)象上的便利.為驗(yàn)證上述猜想,筆者采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法模擬力學(xué)環(huán)境下PSGL-1與FERM蛋白的相互作用及PSGL-1/FERM復(fù)合物的構(gòu)象演變,發(fā)現(xiàn)正如實(shí)驗(yàn)所測(cè)量的[14],PSGL-1與FERM存在較強(qiáng)的相互作用,且在該復(fù)合物解離之前,力學(xué)信號(hào)可以有效地打開(kāi)ITAM-like序列進(jìn)而介導(dǎo)其上一個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)(Y205)的暴露.這對(duì)于后續(xù)的磷酸化和Syk的結(jié)合有著重要的意義.

1材料與方法

1.1系統(tǒng)的建立

模擬體系由分子可視化操作軟件(VMD)[18]搭建,所用晶體結(jié)構(gòu)從PDB晶體庫(kù)下載，為PSGL-1胞內(nèi)近膜端與根蛋白FERM結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的PSGL-1/FERM復(fù)合物[14](見(jiàn)圖1(a),PDB ID為2EMT,分辨率為0.28 nm).

圖1　PSGL-1/FERM復(fù)合物和FERM結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)Fig.1　Crystal structures of PSGL-1/FERM complex and FERM domain

首先對(duì)PSGL-1/FERM進(jìn)行坐標(biāo)調(diào)整:把FERM碳端Cα原子(S313)作為固定原子,固定在原點(diǎn),用于模擬ERM蛋白與細(xì)胞骨架蛋白之間穩(wěn)定的相互作用；把PSGL-1的氮端Cα原子(R402)作為拉伸原子,調(diào)整到x軸上,用于模擬PSGL-1與外界的相互作用.調(diào)整坐標(biāo)后的復(fù)合物溶解于尺寸為16.56 nm×9.68 nm×9.56 nm 的TIP3水框中,按照0.152 mol/L的生理濃度加入NaCl,最終得到原子數(shù)為145 099的體系.

1.2分子動(dòng)力學(xué)模擬

采用納米尺度分子動(dòng)力學(xué)軟件(NAMD)[19]在CHARMM27[20]力場(chǎng)中進(jìn)行模擬,運(yùn)用埃瓦爾德粒子網(wǎng)格算法(PME)計(jì)算靜電相互作用,范德華力作用截止值設(shè)定為1.2 nm.經(jīng)過(guò)了能量最小化后,PSGL-1/FERM復(fù)合物體系接著進(jìn)行了50 ns的能量平衡,并控制溫度為310 K,壓力為1.01×105Pa.在平衡過(guò)程中,PSGL-1/FERM復(fù)合物Cα原子均方根偏差(RMSD)漸趨穩(wěn)定,說(shuō)明復(fù)合物在模擬的生理環(huán)境中已基本平衡(見(jiàn)圖2(a)).

為研究PSGL-1/FERM復(fù)合物在外力作用下的構(gòu)象變化和原子間相互作用的改變,筆者對(duì)平衡后的復(fù)合物進(jìn)行3次恒速度拉伸,拉伸步長(zhǎng)為2 fs/步,拉伸速度為0.5 nm/ns,拉伸方向?yàn)閤軸正方向,虛擬原子與拉伸原子間的彈簧系數(shù)為69.48 pN/nm.每次拉伸時(shí)間不特別設(shè)定,直到PSGL-1與FERM解離為止.

1.3數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)分析過(guò)程中,以溶劑可及表面積(SASA)來(lái)表征拉伸過(guò)程中FERM上ITAM-like序列和活性位點(diǎn)的暴露程度,SASA是生物分子暴露于溶劑中的表面積,SASA越大表明分子越暴露于溶劑中,與其他分子接觸的可能性越大.氫鍵定義為:若供體原子與受體原子之間的距離小于0.35 nm且它們之間的夾角小于30°,則認(rèn)為供體原子與受體原子之間存在氫鍵.氫鍵生存率(H)則定義為氫鍵在模擬過(guò)程中的累計(jì)形成時(shí)間(t1)與模擬時(shí)間(t2)之比,即:

(1)

2結(jié)果與分析

2.1靜態(tài)構(gòu)象分析

本研究的復(fù)合物中,PSGL-1胞內(nèi)域近膜端由16個(gè)氨基酸組成(編號(hào)402—417),其與根蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域(編號(hào)1—313)形成了穩(wěn)定的構(gòu)象.FERM包含與PSGL-1以及諸多粘附分子的結(jié)合位點(diǎn),由A、B、C 3個(gè)子域構(gòu)成.PSGL-1與C子域上的β5C折疊片形成了一個(gè)反向平行的β-β相互作用面,并且該接觸面主要是由氫鍵相互作用介導(dǎo)的[14],如圖1(a)所示. 圖1中，灰色部分為FERM結(jié)構(gòu)，紅色虛線為關(guān)鍵殘基.

細(xì)胞內(nèi)游離的Syk一旦遇到傳統(tǒng)的ITAM序列或者非傳統(tǒng)的ITAM-like序列,便會(huì)與之結(jié)合,實(shí)現(xiàn)Syk的招募過(guò)程[9-11],但實(shí)現(xiàn)這種過(guò)程的前提是ITAM序列先被磷酸化.那么,靜態(tài)條件下,ITAM序列特別是其磷酸化位點(diǎn)能否暴露？周圍是否存在與Syk結(jié)合的構(gòu)象空間?為此,筆者對(duì)FERM的靜態(tài)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)ITAM-like序列(編號(hào)191—208，紅色，Tube模型)作為鉸鏈區(qū)把子域B和C連接起來(lái),其上的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Y191和Y205(黃色，licorice模型)卻分別被B子域和C子域包埋起來(lái)(見(jiàn)圖1(b)).可以想象,由于空間位阻效應(yīng),即使ERM蛋白與Syk在細(xì)胞內(nèi)相遇,若其磷酸化位點(diǎn)不暴露的話,ITAM-like序列是很難被磷酸化的.靜態(tài)條件下的這種包埋結(jié)果提示:力或許在ITAM-like序列磷酸化并招募Syk過(guò)程中發(fā)揮著重要作用. 因此筆者擬采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法觀察復(fù)合物在沒(méi)有外力作用和有外力作用情況下的動(dòng)態(tài)變化.

2.2PSGL-1/FERM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

筆者首先對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行了50 ns的平衡,此時(shí)無(wú)任何外力作用.通過(guò)對(duì)PSGL-1/FERM復(fù)合物重原子的RMSD分析可以看出，在10 ns之后該復(fù)合物已經(jīng)基本穩(wěn)定,如圖2(a)所示.

晶體結(jié)構(gòu)分析表明PSGL-1/FERM接觸面上的氫鍵相互作用主導(dǎo)了復(fù)合物的形成[14],那么復(fù)合物在平衡過(guò)程中的高度穩(wěn)定是否也與這些氫鍵穩(wěn)定性有關(guān)?為此,筆者對(duì)接觸面處的氫鍵數(shù)目及其生存率進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)在平衡過(guò)程中不僅接觸面間的氫鍵數(shù)目保持了較高的穩(wěn)定性,基本維持在8個(gè)左右(見(jiàn)圖2(b)),且靜態(tài)分析中觀察到的重要?dú)滏I[14]均得到了保留. 表1列舉了氫鍵生存率排名前10位的氫鍵,其中TYR410、VAL412 和HSD408 所貢獻(xiàn)的氫鍵均被證明對(duì)復(fù)合物的穩(wěn)定性有著重要的意義,而ARG405則是突變實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證的重要?dú)埢鵞14].上述結(jié)果表明，在動(dòng)態(tài)平衡中,復(fù)合物不僅保留了晶體結(jié)構(gòu)靜態(tài)觀察到的氫鍵相互作用,且結(jié)合較牢固,因此可對(duì)復(fù)合物進(jìn)一步展開(kāi)拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬.

圖2　平衡過(guò)程中PSGL-1/FERM復(fù)合物的RMSD和氫鍵的時(shí)間歷程Fig.2　Time-courses of RMSD and H bond number during PSGL-1/FERM equilibrium

表1平衡過(guò)程中氫鍵生存率排名前10位的氫鍵

Table 1The top ten H bonds with their survival ratio detected in equilibrium

排名PSGL-1殘基供體原子FERM殘基受體原子氫鍵生存率/%1TYR410NILE248O88.702TYR410OILE248N88.403VAL412NARG246O66.154TYR410OHHSD288ND163.015HSD408OPHE250N45.606ARG413NH1SER243O43.527HSD408NPHE250O40.788ARG405NH1ASP252OD235.999ARG405NH2ASP252OD134.8610ARG405NH1ASP252OD132.73

2.3恒速度拉伸過(guò)程中的PSGL-1/FERM復(fù)合物

為了解外力對(duì)蛋白分子相互作用的影響及觀察復(fù)合物在外力作用下的構(gòu)象變化,筆者對(duì)平衡后的復(fù)合物進(jìn)行了3次恒速度拉伸,計(jì)算分析拉伸過(guò)程中拉力和接觸面氫鍵數(shù)目的變化,結(jié)果大致相同,其時(shí)間歷程如圖3所示.圖3(a)-(c)分別示出了3次SMD中拉力的變化,其中每一個(gè)力譜分別代表彼此獨(dú)立的模擬事件；圖3(d)-(f)分別示出了3次SMD中接觸面氫鍵個(gè)數(shù)的變化.拉伸過(guò)程的前20 ns左右,拉力隨時(shí)間不斷上升,但接觸面的氫鍵個(gè)數(shù)卻類似前面的平衡態(tài)保持相對(duì)穩(wěn)定；但拉伸進(jìn)行到20 ns以后,伴隨著拉力的突然下降,氫鍵個(gè)數(shù)急劇下降,最終下降為0,表明復(fù)合物已基本解離,解離時(shí)間集中在20～29 ns之間,解離力集中在250～300 pN之間.

拉力促使復(fù)合物的突然解離,其中伴隨著怎樣的構(gòu)象變化?為了回答這個(gè)問(wèn)題,筆者對(duì)拉伸過(guò)程中PSGL-1/FERM復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了細(xì)致分析,發(fā)現(xiàn)在3次恒速度拉伸過(guò)程中,復(fù)合物都是先解折疊后解離.這里展示其中一次拉伸過(guò)程中的構(gòu)象演化(見(jiàn)圖4). 圖4(a)-(d)分別代表SMD進(jìn)行到0、12、17和27 ns時(shí)FERM結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化. ITAM-like序列(紅色,Tube模型)在拉伸過(guò)程中發(fā)生暴露.在拉伸的初始階段,FERM的α1C螺旋(紫色,NewRibbons模型)和α螺旋(藍(lán)色,New-Ribbons模型)都保持著螺旋狀態(tài)(見(jiàn)圖4(a))；但拉伸進(jìn)行到12 ns左右時(shí)α螺旋開(kāi)始發(fā)生解折疊(見(jiàn)圖4(b))；當(dāng)α螺旋完全解折疊后,拉力繼續(xù)上升,一旦克服了能量障礙,α1C螺旋也接著發(fā)生部分解折疊(見(jiàn)圖4(c)、(d)),拉力能使α螺旋發(fā)生完全解折疊,卻不足以使α1C螺旋也發(fā)生完全解折疊.隨著局部結(jié)構(gòu)的解折疊,拉力持續(xù)上升至250～300 pN,此時(shí)復(fù)合物不敵外力而發(fā)生解離.

圖3　3次SMD過(guò)程中拉力和氫鍵的時(shí)間歷程Fig.3　Time-courses of force and H bond number in three SMD

2.4磷酸化位點(diǎn)Y205的暴露

2.4.1構(gòu)象分析

PSGL-1與FERM解離前的解折疊過(guò)程一方面驗(yàn)證了PSGL-1與FERM復(fù)合物的牢固結(jié)合,另一方面也提示該解折疊過(guò)程可能有利于ITAM-like序列的打開(kāi)以及其上磷酸化位點(diǎn)的暴露.通過(guò)對(duì)3次拉伸過(guò)程中ITAM-like序列及其磷酸化位點(diǎn)的模擬軌跡進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):在PSGL-1/FERM復(fù)合物的構(gòu)象演變過(guò)程,FERM上的ITAM-like序列隨著解折疊的進(jìn)行逐步被打開(kāi)(見(jiàn)圖4).拉伸前,ITAM-like序列像一條蜷曲的繩子一樣,包埋在B子域和C子域之間并把B子域和C子域連接起來(lái)(見(jiàn)圖4(a))；隨著拉伸的進(jìn)行,C子域逐漸遠(yuǎn)離B子域,此時(shí)ITAM-like序列像繩子一樣被“拉直”并被“抽離”出來(lái),在復(fù)合物解離前,拉伸時(shí)間越長(zhǎng),拉力越大,ITAM-like序列被拉得越直,拉得越開(kāi),在溶劑中的暴露程度越大(見(jiàn)圖4(b)-(d)).

同時(shí),原本包埋在FERM中的磷酸化位點(diǎn)Y205隨著解折疊的進(jìn)行也不斷被暴露,與ITAM-like序列類似,在復(fù)合物解離前,拉伸時(shí)間越長(zhǎng),拉力越大,Y205的暴露程度越大(見(jiàn)圖5(a)-(d)，分別代表SMD進(jìn)行到0、10、20 和30 ns時(shí)FERM結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化).3次SMD均能觀察到ITAM-like序列(紅色,Tube模型)和Y205(黃色,Licorice模型)的暴露,卻不能觀察到Y(jié)191(黃色,Licorice模型)的暴露,由始至終,Y191一直被包埋在蛋白質(zhì)里面,并且朝向都向內(nèi)(見(jiàn)圖5).

圖4　SMD過(guò)程中FERM結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化Fig.4　Conformational changes of FERM domain during SMD

圖5　SMD過(guò)程中磷酸化位點(diǎn)Y205的暴露Fig.5　Exposition of phosphorylation site Y205 during SMD

2.4.2SASA值分析

為了探明外力對(duì)ITAM-like序列、Y191和Y205暴露程度的影響,以半徑為0.14 nm的水分子作為探針?lè)肿?對(duì)三者在靜態(tài)、無(wú)外力動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程及有外力拉伸過(guò)程的SASA值進(jìn)行計(jì)算和跟蹤分析.在靜態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)中,ITAM-like序列、Y191和Y205的SASA值分別為6.308、0.032和0.395 nm2,表明靜態(tài)條件下ITAM-like序列及其磷酸化位點(diǎn)周圍確實(shí)存在較大空間位阻.

圖6展示的是50 ns平衡和3次恒速度拉伸中ITAM-like序列、Y191和Y205的SASA時(shí)間歷程.可以看出,無(wú)外力作用的平衡過(guò)程中三者的SASA值都基本處于平均值上下,波動(dòng)幅度不大,說(shuō)明平衡過(guò)程中三者并未發(fā)生暴露(見(jiàn)圖6(a)、(e)、(i)).而它們?cè)?次恒速度拉伸時(shí)SASA值的時(shí)間歷程則表現(xiàn)了很大的區(qū)別:ITAM-like序列(見(jiàn)圖6(b)-(d))和Y205(見(jiàn)圖6(j)-(l))的SASA值都有明顯的增大,前者從最初的8.00 nm2最大能增加到13.00 nm2左右,后者從最初的0.35 nm2最大能增加到1.80 nm2左右,且波動(dòng)幅度加??；但Y191的SASA值相對(duì)變化不大,一直保持在0.18 nm2以下(見(jiàn)圖6(f)-(h)).

筆者進(jìn)一步對(duì)三者平衡及恒速度拉伸過(guò)程的SASA值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，發(fā)現(xiàn):ITAM-like序列在平衡及拉伸過(guò)程的值分別為(7.703 2±0.034 2) nm2和(9.379 0±0.075 5) nm2,SASA增加約22%,u檢驗(yàn)結(jié)果為P<0.01,兩者具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Y205的SASA值分別為(0.391 2±0.007 0) nm2和(0.683 9±0.021 3) nm2,SASA增加近75%,兩者之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極其顯著；Y191的SASA值分別為(0.047 9±0.001 6) nm2和(0.042 0±0.002 3) nm2,雖然兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.01

以上結(jié)果顯示,力是促使ITAM-like序列磷酸化并招募Syk的重要條件:血流環(huán)境下,PSGL-1胞外區(qū)不斷受到流體剪應(yīng)力和選擇素的作用,并通過(guò)胞內(nèi)域把力學(xué)信號(hào)傳遞給ERM蛋白,使原本包埋在蛋白里的ITAM-like序列特別是Y205發(fā)生暴露,增大了其被磷酸化并與Syk結(jié)合的可能性,為ERM蛋白招募Syk提供了條件.

圖6　平衡和SMD過(guò)程中SASA的時(shí)間歷程Fig.6　Time-courses of SASAs in equilibrium and three SMD

3討論

ITAM最初被定義為T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體和Fc受體胞質(zhì)尾信號(hào)鏈的共同序列.如今,YxxL/Ix(6-12)YxxL/I序列在許多受體和跨膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)被發(fā)現(xiàn),并在下游的信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著關(guān)鍵的角色[21].當(dāng)受體受刺激以后,ITAM序列通常先被Src家族激酶酪氨酸磷酸化,然后含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白(主要是Syk酪氨酸激酶家族)會(huì)結(jié)合到磷酸化的ITAM上[22-23],所以ITAM序列磷酸化位點(diǎn)的暴露對(duì)于啟動(dòng)下游信號(hào)至關(guān)重要.PSGL-1的胞內(nèi)域缺乏傳統(tǒng)的ITAM序列,但可以通過(guò)其胞內(nèi)近膜端與帶有非傳統(tǒng)的ITAM-like序列的ERM蛋白結(jié)合而招募Syk[3,12].同時(shí)PSGL-1又是一個(gè)力學(xué)傳感器,能轉(zhuǎn)導(dǎo)外部血流的力學(xué)信號(hào),而目前對(duì)于力如何與化學(xué)信號(hào)耦合在PSGL-1/ERM招募Syk中的作用尚不清楚.因此,筆者采用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法,通過(guò)比較PSGL-1/FERM復(fù)合物平衡過(guò)程與拉伸過(guò)程中接觸面殘基的相互作用和構(gòu)象變化,希望在原子水平上再現(xiàn)血流環(huán)境所呈遞的力學(xué)影響,探明力學(xué)信號(hào)在ERM蛋白招募Syk中的作用和尋找可能的分子結(jié)構(gòu)機(jī)制.

晶體結(jié)構(gòu)分析表明，PSGL-1與ERM蛋白結(jié)合是比較牢固的,且在整個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中始終保持了較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(見(jiàn)圖2(a))和氫鍵生存率(見(jiàn)表1),氫鍵數(shù)目也十分保守(見(jiàn)圖2(b)),從一個(gè)側(cè)面證明PSGL-1/ERM復(fù)合物在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要作用.無(wú)論在靜態(tài)晶體結(jié)構(gòu)還是動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中,ERM蛋白ITAM-like序列上兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)Y191和Y205都是包埋在FERM里面的(見(jiàn)圖1(b),圖6(a)、(e)、(i)),由于空間位阻效應(yīng),即使Syk與之相遇也很難實(shí)現(xiàn)對(duì)其的磷酸化過(guò)程.然而在外力作用下,復(fù)合物構(gòu)象不再穩(wěn)定,ERM蛋白會(huì)發(fā)生一個(gè)先解折疊、后解離的過(guò)程(見(jiàn)圖4).在解折疊過(guò)程中ITAM-like序列和Y205會(huì)隨著拉伸的進(jìn)行逐漸被暴露(見(jiàn)圖4、5),相應(yīng)地,ITAM-like序列和Y205的SASA也顯著增大(見(jiàn)圖6),說(shuō)明拉力會(huì)有效促進(jìn)ITAM-like序列和Y205的暴露,為磷酸化和招募Syk提供了可能.

PSGL-1通過(guò)其ERM蛋白結(jié)合區(qū)與ERM蛋白FERM結(jié)構(gòu)域的C子域相結(jié)合[14],所以在恒速度拉伸過(guò)程中力首先經(jīng)由PSGL-1傳遞至C子域,使其逐漸遠(yuǎn)離B子域,而ITAM-like序列作為連接B子域和C子域的鉸鏈,伴隨著C子域的遠(yuǎn)離逐漸像繩子一樣被“拉直”被“抽離”出來(lái),最終很大程度地暴露于溶劑中(見(jiàn)圖4).Y205位于ITAM-like序列上,被C子域包埋,并且比較靠近PSGL-1/FERM結(jié)合區(qū),拉力使C子域在拉伸過(guò)程“打散”,導(dǎo)致了Y205的暴露(見(jiàn)圖5).構(gòu)象分析和SASA變化都表明，Y191始終被包埋在蛋白里面,這很可能是因?yàn)閅191的朝向一直向內(nèi)并遠(yuǎn)離PSGL-1/FERM結(jié)合區(qū),加上其周圍存在比較復(fù)雜的構(gòu)象環(huán)境,使力學(xué)信號(hào)很難傳遞到Y(jié)191使之暴露.

4結(jié)語(yǔ)

本研究提出了一個(gè)力-化學(xué)耦合過(guò)程:在炎癥發(fā)生過(guò)程中,選擇素/PSGL-1的結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上的快速滾動(dòng),并通過(guò)PSGL-1胞內(nèi)域把力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)給ERM蛋白,使原本包埋在FERM的ITAM-like序列特別是磷酸化位點(diǎn)Y205逐步暴露,為其磷酸化并與Syk的結(jié)合提供了最大的空間可能.本研究揭示了一條經(jīng)由PSGL-1胞內(nèi)域激活Syk的力學(xué)信號(hào)通路,并且在原子層面上對(duì)于PSGL-1/ERM/Syk之間的相互作用給予了闡釋,這為PSGL-1/ERM/Syk介導(dǎo)的下游信號(hào)的深入研究以及基于三者結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)和篩選提供了重要參考.

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Exposition of Phosphotyrosine Site on ITAM-like Motif of ERM Proteins Mediated by Force Through PSGL-1

WUJian-huaKUANGXiao-minLIUWen-pingFANGYing

(School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong, China)

Abstract:P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) engaged by ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins plays an important role in recruiting spleen tyrosine kinase (Syk) and activating leukocyte in the process of inflammatory response.Firstly, the crystal structure of radixin FERM domain indicates that the steric effect on ITAM-like motif and phosphorylation sites (Y191 and Y205) can hamper their phosphorylation by Src family tyrosine kinase and their combination with Syk.Then, steered molecular dynamics (SMD) simulation is carried out to explore the interaction between the complex of PSGL-1 juxtamembrane peptide and radixin FERM domain under force load.Both conformation analysis and solvent accessible surface variant show that the mechanical signal transmitting through PSGL-1 cytoplasmic region can mediate the exposition of phosphotyrosine site Y205 on ITAM-like motif of radixin.The results of this study present a mechanical signal pathway from PSGL-1 cytoplasmic region to Syk and expound the interaction mechanism of PSGL-1/ERM/Syk at atomic level.

Key words:PSGL-1; ERM protein; Syk;ITAM-like motif; steered molecular dynamics

收稿日期：2015- 09- 07*基金項(xiàng)目： 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170887，11272125，11432006)

Foundation items: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31170887,11272125,11432006)

作者簡(jiǎn)介：吳建華(1959-) ,男,博士,教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞與分子生物力學(xué)研究.E-mail:wujianhua@scut.edu.cn ? 通信作者： 方穎(1966-)，女，副教授，主要從事細(xì)胞與分子生物力學(xué)研究.E-mail:yfang@scut.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q66

doi：10.3969/j.issn.1000-565X.2016.03.018