美洲大蠊提取物抗肝損傷的實驗研究

張彤，楊勝群，鄒俊波，闕昌田，桑文濤，曾南

·藥理毒理·

美洲大蠊提取物抗肝損傷的實驗研究

張彤，楊勝群，鄒俊波，闕昌田，桑文濤，曾南

目的：觀察美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物對小鼠急性肝損傷模型及CCl4所致大鼠慢性肝損傷模型的影響，為美洲大蠊抗肝損傷的臨床應(yīng)用及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定實驗依據(jù)。方法：美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物連續(xù)灌胃給予小鼠10天，分別采用灌胃醋氨酚、60%乙醇及腹腔注射CCl4進行小鼠急性肝損傷造模，測定模型小鼠血清ALT與AST水平、肝組織SOD與MDA水平及肝臟、脾臟指數(shù)以評價受試藥物的抗急性肝損傷作用；采用每周兩次灌胃CCl4，連續(xù)8周的方式制備慢性肝損傷大鼠模型，測定模型動物血清ALT、AST水平及肝、脾、胸腺指數(shù)以評價藥物的抗慢性肝損傷作用。結(jié)果：美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物49.13 mg．kg-1顯著降低酒精性與CCl4性急性肝損傷模型小鼠血清AST、ALT水平(P＜0.05)，對醋氨酚模型小鼠血清AST、ALT水平有降低趨勢(P＞0.05)，能顯著性降低醋氨酚模型小鼠脾臟指數(shù)(P＜0.05)；65.51 mg．kg-1顯著降低酒精性急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平(P＜0.05)，32.75 mg．kg-1顯著降低血清ALT與肝組織MDA水平(P＜0.05)。美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物75.78 mg．kg-1顯著降低CCl4所致慢性肝損傷模型大鼠血清AST、ALT水平(P＜0.05)，45.76、 75.78 mg．kg-1顯著提高模型大鼠胸腺指數(shù)(P＜0.05)，45.76 mg．kg-1明顯降低肝臟指數(shù)(P＜0.05)。結(jié)論：美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物具有抗急性和慢性肝損傷的作用，該部位可能是其保肝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物；醋氨酚性急性肝損傷；酒精性急性肝損傷；CCl4急性肝損傷； CCl4慢性肝損傷

美洲大蠊( Periplaneta americana L)屬于昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱蟑螂。全世界被發(fā)現(xiàn)并記錄的蟑螂種類有3000余種，中國蟑螂種類記載已超過500余種，但其中被開發(fā)利用的僅有幾種，美洲大蠊就是頗具代表性的一種[1]。美洲大蠊其藥用歷史最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，之后的很多醫(yī)藥學(xué)專著都有記載，《本草綱目》曰：“蜚蠊，行夜， 螽三種，西南夷皆食之，混呼為負盤俗又訛盤為婆，而諱稱為香娘子也”。中醫(yī)認為美洲大蠊具有活血散瘀、解毒消疳、利尿消腫等功效，用于癥瘕積聚，小兒疳積，腳氣水腫，疔瘡、腫毒及蟲蛇咬傷?，F(xiàn)代藥理研究表明，美洲大蠊提取物具有抗腫瘤[2]、促進組織修復(fù)[3]、抗菌和抗病毒[4]、抗氧化[5]和保肝作用[6]。本研究基于前期工藝篩選結(jié)果，即美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物可能為其抗肝損傷的有效部位，為進一步明確其抗肝損傷作用，采用醋氨酚、60%乙醇及CCl4制備3種小鼠急性肝損傷模型，以及CCl4所致的大鼠慢性肝損傷模型，觀察該提取物的保肝效應(yīng)，旨在為其臨床應(yīng)用、工藝優(yōu)化及物質(zhì)基礎(chǔ)尋找提供一定藥理學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級昆明小鼠，雄性，體重18～22 g；SD大鼠，雄性，體重160～180g ，均購自成都達碩實驗動物有限公司，動物合格證：SCXK(川）2013-15。飼養(yǎng)于國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理科研三級實驗室（NO.TCM-2009-315），室內(nèi)光照、濕度、溫度適宜，通風(fēng)條件良好，環(huán)境相對安靜，每籠6～7只。

1.2 藥物

美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物，由成都百草和濟科技有限公司提供，出膏率5.3%。提取工藝：取美洲大蠊活蟲適量，低溫下75%乙醇粉碎，過濾，藥渣加10倍量水溶液提取2次，第一次提取1.5 h，第二次1 h，合并水提溶液，減壓濃縮并干燥，得活蟲冷浸藥渣水提取物。聯(lián)苯雙酯滴丸，批號A02131003，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司。對乙酰氨基酚，批號140301，成都市天臺山制藥有限公司。

1.3 試劑

無水乙醇(批號2015010401，成都市科龍化工試劑廠) ；四氯化碳（批號2014011601，成都市科龍化工試劑廠）。AST試劑盒（批號20150107、20150512、20150611、20151107）、ALT試劑盒（批號20150107、20150512、20150611、20151107）、SOD試劑盒（批號20150618、20150917）、MDA試劑盒（批號20150508、20150617）、膽紅素試劑盒（批號20150109），均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器

電子天平（型號BS323S，精度0.001，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。數(shù)控超聲波清洗器（型號DL720D，上海之信儀器有限公司）。ARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數(shù)儀(型號3001，美國Thermo公司)。臺式高速冷凍離心機（型號ST16R，美國Thermo公司）。臺式低速離心機（型號TD24AWS,湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對醋氨酚致小鼠急性肝損傷的影響

健康SPF級昆明種小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組（5.8 mg．kg-1）、美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物低(32.75 mg．kg-1)、中(49.13 mg．kg-1)、高劑量(65.51 mg．kg-1)組。各組小鼠按0.2 ml/10g 給藥體積灌胃相應(yīng)的藥物，空白組和模型組小鼠灌胃給予等量蒸餾水，連續(xù)灌胃10 d。末次給藥2 h后，除空白組外其余各組小鼠灌胃200 mg．kg-1醋氨酚進行造模，空白組灌胃給予等量溶劑。造模后小鼠禁食不禁水16 h，小鼠取血分離血清，檢測AST、ALT活力，并剖取脾臟和肝臟稱重，計算臟器指數(shù)[7]。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表1。

表1 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對醋氨酚致小鼠急性肝損傷模型的影響(±S)

表1 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對醋氨酚致小鼠急性肝損傷模型的影響(±S)

空白對照—5.35±0.79 0.42±0.11 28.03±7.12**12.05±4.71**模型對照—5.06±0.36 0.44±0.1339.07±7.9931.56±7.45聯(lián)苯雙酯5.84.79±0.35 0.34±0.05*37.11±5.6038.32±8.32

注：與模型組比較，*P＜0．05， **P＜0．01；n=8-12

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組小鼠血清AST、ALT活性明顯增高（P＜0.01），提示模型成功；與模型對照組比較，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物 49.13mg/kg劑量對血清AST、ALT活性異常增高有降低趨勢，此外其能顯著降低模型小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.01）。

2.2 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精所致小鼠急性肝損傷模型的影響

動物分組、給藥方法及給藥周期同實驗2.1。各組連續(xù)灌胃10 d，末次給藥后2 h，除空白組外其余各組小鼠灌胃60%乙醇14 mL．kg-1造模，空白組灌胃等量溶劑。造模后小鼠禁食不禁水8 h，小鼠取血分離血清，檢測AST、ALT活力，同時剖取小鼠脾臟和肝臟稱重，計算肝臟、脾臟指數(shù)[8]，并用生理鹽水制備10%肝臟勻漿，檢測SOD、MDA水平。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表2、表3。

表2 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精性急性肝損傷模型小鼠臟器指數(shù)及酶活性的影響（±S）

表2 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精性急性肝損傷模型小鼠臟器指數(shù)及酶活性的影響（±S）

注：與模型組比較，*P＜0.05, **P＜0.01；n=8-12

組別劑量肝臟指數(shù) 脾臟指數(shù)ASTALT ( mg．kg-1)(g/100g)(g/100g)（U/L）（U/L）空白對照—5.35±0.79 0.42±0.11 28.03±7.12**12.05±4.71**模型對照—5.03±0.42 0.30±0.05 52.32±22.61 70.56±23.41聯(lián)苯雙酯5.84.66±0.80 0.32±0.05 47.23±15.32 59.16±12.58水提物32.755.06±0.35 0.29±0.05 50.30±11.4651.42±8.34*水提物49.135.12±0.44 0.38±0.09 33.74±5.90*55.85±9.61*水提物65.514.89±0.34 0.29±0.06 32.52±7.58**36.55±14.81**

表3 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精性急性肝損傷模型小鼠肝組織SOD、MDA水平的影響（±S）

表3 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精性急性肝損傷模型小鼠肝組織SOD、MDA水平的影響（±S）

注：與模型組比較，*P＜0.05

MDA (nmol/mgprot)空白對照—12754.41±193.047.25±1.66模型對照—10626.55±164.946.64±3.28聯(lián)苯雙酯5.810746.27±69.514.65±1.23水提物32.7511746.63±73.894.2±1.49*水提物49.1311709.94±62.664.94±2.05水提物65.518694.61±57.25.34±1.37組別劑量(mg．kg-1)樣本（n）SOD（U/mgprot）

結(jié)果表明，與空白對照組比較，酒精性急性肝損傷模型小鼠血清AST、ALT活性明顯增高（P＜0.01），提示模型成功；與模型對照組比較，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物49.13、65.51 mg．kg-1劑量顯著性降低血清AST、ALT活力（P ＜0.01或P ＜0.05），32.75 mg．kg-1顯著性降低血清ALT活性及肝組織MDA水平（P ＜0.05）。

2.3 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對四氯化碳急性肝損傷小鼠模型的影響

健康SPF級昆明種小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組（5.8 mg．kg-1）、美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物組(49.13 mg．kg-1)，連續(xù)灌胃給藥10 d。末次灌胃給藥2 h后，。0.35% CCl4植物油溶液0.01mL/10 g腹腔注射造模，造模后禁食不禁水22 h，小鼠取血分離血清，檢測AST、ALT和總膽紅素水平，剖取小鼠脾臟和肝臟稱重，計算肝臟、脾臟指數(shù)[6]，并用生理鹽水制備10%肝臟勻漿，檢測SOD、MDA水平。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表4、表5。

表4 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對CCl4急性肝損傷模型小鼠臟器指數(shù)及肝功能的影響（±S）

表4 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對CCl4急性肝損傷模型小鼠臟器指數(shù)及肝功能的影響（±S）

注：與模型組比較，*P＜0.05, **P＜0.01；n=8-12

總膽紅素(μmol.L-1)空白對照-5.20±0.720.37±0.094.41±3.68*6.85±13.97**0.14±0.05*模型對照-5.27±0.570.37±0.1124.8±18.54 121.40±57.74 0.32±0.19聯(lián)苯雙酯5.84.79±0.260.36±0.096.3±2.95**68.3±47.80**0.32±0.11水提物49.134.96±0.390.34±0.168.39±4.77*38.3±37.05**0.29±0.11組別劑量(mg．kg-1)肝臟指數(shù)（g/100g）脾臟指數(shù)（g/100g）AST（U/L）ALT（U/L）

表5 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對CCl4急性肝損傷模型小鼠肝組織SOD、MDA水平的影響（±S）

表5 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對CCl4急性肝損傷模型小鼠肝組織SOD、MDA水平的影響（±S）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

MDA ( nmol/mgprot )空白對照-10568.3±62.64**3.43±0.60模型對照-11477.01±36.133.42±1.03聯(lián)苯雙酯5.811521.73±213.003.13±0.88水提物49.1311493.63±73.452.41±0.48**組別劑量(mg．kg-1)樣本（n）SOD（U/mgprot）

結(jié)果表明，與空白對照組比較，CCl4急性肝損傷模型小鼠血清AST、ALT活性明顯增高（P＜0.01），提示造模成功；與模型組比較，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物49.13mg．kg-1顯著性降低血清AST、ALT活性及肝組織MDA水平（P ＜0.05或P＜0.01）。

2.4 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對四氯化碳慢性肝損傷大鼠模型的影響

取健康SD大鼠，按體重分層隨機正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組（1.93 mg．kg-1）、美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物低、高劑量組（45.56、75.78 mg．kg-1）。除正常對照組外，其余各組大鼠按 1 mL．kg-1灌胃 40% CCl4橄欖油溶液造模，每周 2次，連續(xù)8周，正常對照組給予等體積橄欖油。造模第二周開始灌胃給藥，正常對照及模型組給予等體積水溶液，連續(xù)給藥 7周，每周稱重一次。末次給藥后，大鼠禁食不禁水16 h，稱體重，腹主動脈取血分離血清；剖取大鼠肝臟、脾臟、胸腺，稱重計算肝、脾、胸腺指數(shù)。按試劑盒說明檢測血清AST、ALT水平[9]。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果見表6。

表6 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物對CCl4致慢性肝損傷大鼠模型的影響（±S）

表6 美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提物對CCl4致慢性肝損傷大鼠模型的影響（±S）

注：與模型組比較 ，*P＜0.05, **P＜0.01

ALT（U/L ）空白對照-102.59±0.19*0.19±0.040.10±0.03**26.61±6.26**20.42±8.95**模型對照-132.98±0.470.22±0.050.06±0.02281.87±69.11374.65±87.84聯(lián)苯雙酯1.9382.64±0.220.19±0.030.10±0.02**147.41±37.03**102.04±19.54**水提物45.5682.59±0.16*0.20±0.030.10±0.03**291.46±40.07343.80±31.34水提物75.7893.05±0.320.21±0.070.11±0.04**190.88±84.44*268.66±69.62**組 別劑量(mg．kg-1)樣本（n）肝臟指數(shù)（g/100g）脾臟指數(shù)（g/100g）胸腺指數(shù)（g/100g）AST（U/L ）

結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型組大鼠血清AST和ALT活性、肝臟指數(shù)顯著性升高（P ＜0.05或P＜0.01），提示模型動物存在肝功能異常表現(xiàn)；與模型組比較，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物75.78 mg．kg-1顯著降低血清AST、ALT活性，45.76、 75.78 mg．kg-1能明顯提高模型大鼠胸腺指數(shù)，45.76 mg．kg-1顯著降低模型大鼠肝臟指數(shù)。

3 討論

在評價藥物抗肝損傷作用的實驗研究中，醋氨酚所致急性肝損傷模型是藥物性肝損傷的代表模型，此外酒精性肝損傷與CCl4所致的化學(xué)性肝損傷模型也常被采用。醋氨酚可使小鼠肝臟過氧化反應(yīng)增強, 產(chǎn)生過多自由基而引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化造成細胞損傷[10]，大劑量的醋氨酚在代謝過程中產(chǎn)生大量N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)，后者有親電性和強大氧化作用，與生物大分子共價結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)巰基被氧化和芳香基化，以及生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起肝細胞變性壞死[11]。酒精性肝損傷是臨床常見的肝臟疾病，包括急性酒精性肝損傷、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化。當機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶(ADH)的催化下，乙醇氧化成乙醛，而乙醛作為黃嘌呤氧化酶的底物會激活黃嘌呤氧化酶，使超氧陰離子和自由基生成增加，引起脂質(zhì)過氧化，造成肝細胞膜損害，引起肝臟功能紊亂[12-14]。CCl4是致急、慢性肝損傷動物模型的常用化學(xué)試劑，CCl4進入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟細胞色素 P450 的代謝，生成三氯甲基自由基，后者則激發(fā)細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，導(dǎo)致肝臟功能受損[15]。上述所有肝損傷動物模型，無論急性還是慢性均會表現(xiàn)出血清ALT、AST活性異常升高，即提示肝功能異常，受試藥物如能對抗兩種酶活性的異常升高，則表明藥物具有一定的抗肝損傷作用。

本次實驗發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物對酒精性急性肝損傷模型，CCl4致急、慢性肝損傷模型動物血清轉(zhuǎn)氨酶活性的異常增高，均有顯著降低作用，對醋氨酚所致急性肝損傷模型小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性有降低趨勢；同時實驗表明，藥物能降低CCl4急性肝損傷模型小鼠肝組織MDA含量；能提高CCl4所致慢性肝損傷模型大鼠的胸腺指數(shù)，降低肝臟指數(shù)。由此提示，美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物具有抗肝損傷作用，作用發(fā)揮可能與其提高機體免疫功能、抗氧化及促進修復(fù)等環(huán)節(jié)相關(guān)。美洲大蠊活蟲冷浸藥渣水提取物可能是其保肝效應(yīng)發(fā)揮的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。究其保肝效應(yīng)的進一步分子作用機制及有效成分的進一步分離、驗證，有待深入研究。

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（責任編輯：陳思敏）

Study on the effects of Periplaneta americana L extract on liver injury

/ZHANG Tong, YANG Sheng-qun, ZOU Jun-bo, QUE Chang-tian, SANG Wen-tao, ZENG Nan//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:This study was aimed to investigate the effect of water extract of Periplaneta americana L by cooling extraction on live insects (WEoPa) on acute liver injury in mice and CCl4-induced chronic liver injury in rats, so as to provide certain experimental basis for the clinical application and basic research of Periplaneta americana L on anti-liver injury.Method:WEoPa was intragastricly administered to mice for 10 days. Then acute liver injury animal models were established by gavage of paracetamol, 60% alcohol and intraperitoneal injection of CCl4, respectively. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and glutamic oxalacetic transaminase (AST) in serum, superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver were determined. Viscera indices such as liver and spleen were calculated to evaluate the effect of WEoPa on acute liver injury in mice. The chronic liver injury animal model was established by intragastric administration of CCl4to rats twice a week for 8 weeks, then WEoPa was intragastricly given for 7 weeks. The levels of ALT and AST in serum, viscera indices such as liver, spleen and thymus were calculated to evaluate the effect of WEoPa on chronic liver injury in rats.Result:Intragastric administration of 49.13 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum of acute liver injury mice induced by alcohol and CCl4(P＜0.05), and tended to decrease the levels of ALT and AST in serum (P＞0.05) while obviously decrease the spleen indices of mice induced by paracetamol (P＜0.05). 65.51 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum (P＜0.05), while 32.75mg．kg-1can significantly decrease the levels of ALT in serum and MDA in liver tissue of acute liver injury mice induced by alcohol (P＜0.05). 75.78 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum (P＜0.05), while 45.76 and 75.78 mg．kg-1WEoPa can significantly increase thymus indices, 45.76 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease liver indices of chronic liver injuryrats induced by CCl4 (P＜0.05).Conclusion:WEoPa has protection effects on acute and chronic liver injury, suggesting that it’s maybe one of the important material basis playing the role of anti-liver injury.

Water extract of Periplaneta americana L; paracetamol-induced acute liver injury; alcohol-induced acute liver injury; CCl4-induced acute liver injury; CCl4-induced chronic liver injury

R 285.5

A

1674-926X(2016)05-009-04

四川省科技廳中藥藥理四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊（2014TD0007）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610075

張彤，在讀碩士研究生，主要從事中藥藥效學(xué)研究

Tel：18382148201 Email：983324561@qq.com

曾南，教授，主要從事中藥藥效與毒理研究

Tel：13198502352 Email：zengnan966@126.com

2016-02-18