JAK2/STAT3通路介導(dǎo)熱休克蛋白70對(duì)腦出血的神經(jīng)保護(hù)作用

袁志俊　李小剛　何曉英

JAK2/STAT3通路介導(dǎo)熱休克蛋白70對(duì)腦出血的神經(jīng)保護(hù)作用

袁志俊李小剛何曉英

646000四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

摘要:目的觀察蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號(hào)通路特異性拮抗劑α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺〔alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine，AG-490〕對(duì)腦出血大鼠腦組織熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)、磷酸化蛋白酪氨酸激酶 2(phosphorylated janus kinase 2, P-JAK2)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,P-STAT3)表達(dá)的影響，并分析HSP70與P-JAK2、P-STAT3的相關(guān)性，探討JAK2/STAT3信號(hào)通路是否介導(dǎo)HSP70對(duì)大鼠腦出血后的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法將健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦出血和AG-490組；采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型；各組按造模成功后時(shí)間分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d共5個(gè)亞組，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity scores，NSS)；免疫組化染色檢測(cè)血腫周?chē)鶫SP70表達(dá)，采用Western blot檢測(cè)大鼠血腫周?chē)X組織P-JAK2、P-STAT3的表達(dá)。結(jié)果腦出血組和AG-490組HSP70、P-JAK2、P-STAT表達(dá)均高于假手術(shù)組和正常組(P<0.05)，并于造模后48 h達(dá)高峰(P<0.05)；AG-490組HSP70、P-JAK2、P-STAT表達(dá)較腦出血組低(P<0.05)；腦出血組HSP70表達(dá)與NSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P<0.05)，HSP70表達(dá)與P-JAK2、P-STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.05；r=0.447， P<0.05)。結(jié)論JAK2/STAT3信號(hào)通路可能通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)進(jìn)而對(duì)大鼠腦出血后起神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:腦出血；HSP70蛋白質(zhì)類(lèi)；janus激酶2； STAT3轉(zhuǎn)錄因子

腦出血是常見(jiàn)病，其年發(fā)病率為60～80/10萬(wàn)人，在我國(guó)約占急性腦血管病的30%，其死亡率在急性腦血管病中最高。蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它是多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明JAK2/STAT3通路激活與腦損傷密切相關(guān)，它參與腦缺血再灌注損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷等的調(diào)控[1-2]。α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺〔alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine，AG-490〕是JAK2/STAT3信號(hào)通路的一種特異性拮抗劑，結(jié)構(gòu)類(lèi)似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位置，抑制應(yīng)激反應(yīng)時(shí)STAT3的磷酸化，從而降低STAT3的活性[3]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是一種應(yīng)激蛋白，也是一種內(nèi)源性的細(xì)胞保護(hù)蛋白，在正常組織中表達(dá)較少，當(dāng)機(jī)體受到損傷、感染、中毒等刺激時(shí)表達(dá)增多。Madamanchi 等[4]的研究結(jié)果顯示，JAK2/STAT3信號(hào)通路活化可激活HSP70基因，促進(jìn)HSP70蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型，并于造模前給予腹腔注射AG-490干預(yù)，檢測(cè)大鼠血腫周?chē)鶫SP70及磷酸化JAK2(P-JAK2)、磷酸化STAT3(P-STAT3)的表達(dá)變化，旨在探討JAK2/STAT3信號(hào)通路在HSP70表達(dá)變化中的介導(dǎo)作用，為進(jìn)一步明確腦出血后腦損傷的發(fā)病機(jī)制及治療提供線索。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡2～3個(gè)月(由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、腦出血組和AG-490干預(yù)組，各組25只。按造模成功后時(shí)間將各組大鼠再分為6 h、24 h、48 h、72 h、7 d共5個(gè)亞組，每亞組5只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 SDS-PAGE凝膠、5%(質(zhì)量濃度)牛血清白蛋白、HSP70抗體、P-JAK2單克隆抗體、P-STAT3單克隆抗體、AG-490、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司。鼠腦立體定向儀、50 μL微量注射儀購(gòu)自世界精密儀器商貿(mào)(上海)有限公司。其他儀器包括Olympus光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)、Image-J圖像分析系統(tǒng)等。

1.3方法

1.3.1腦出血模型制備：采用二次注入法建立腦出血模型[5]。該方法采用尾動(dòng)脈為供血?jiǎng)用}，雖然有一定創(chuàng)傷，但不影響大鼠肢體的功能，行為學(xué)評(píng)分更準(zhǔn)確，成功率較高。術(shù)畢根據(jù)Longa等[6]5級(jí)評(píng)定方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，1～3分者為大鼠腦出血造模成功。AG-490干預(yù)組大鼠于造模成功后立即予腹腔注射AG-490〔0.15 mg/(kg·d)〕，共3 d，假手術(shù)組大鼠按相同方案注入等量生理鹽水，對(duì)照組大鼠未予任何處理。

1.3.2神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity scores，NSS)：采用Garcia等[7]NSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡測(cè)試、反射消失或不正常運(yùn)動(dòng)、行走。18 分為正常，13～17分為輕度損害，7～12 分為中度損害，1～6分為重度損害。

1.3.3免疫組化：采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HSP70蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。選擇5個(gè)不重疊的血腫區(qū)域采集圖像，然后用Image-Pro-Plus5.0軟件分析蛋白陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值，并計(jì)算平均值。

1.3.4Western blot檢測(cè)：采用Western blot檢測(cè)P-JAK2和P-STAT3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分析蛋白條帶的相對(duì)密度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組內(nèi)不同時(shí)間均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NSS評(píng)分 正常組與假手術(shù)組NSS評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腦出血組和AG-490組NSS評(píng)分均低于假手術(shù)組(P<0.05)，AG-490組NSS評(píng)分高于腦出血組(P<0.05)。腦出血組和AG-490組大鼠造模成功后48 h神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2免疫組化 正常組及假手術(shù)組未見(jiàn)或可見(jiàn)少量HSP70表達(dá)；腦出血組和AG-490組造模成功后6 h血腫周?chē)梢?jiàn)少量HSP70表達(dá)， 24 h開(kāi)始明顯增多，48 h達(dá)高峰(P<0.05)，7 d仍有少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)均高于假手術(shù)組(P<0.05)，AG0-490組各時(shí)間點(diǎn)HSP70表達(dá)均低于腦出血組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

2.3Western blot檢測(cè) 各組大鼠血腫周?chē)M織P-JAK2和P-STAT3表達(dá)變化趨勢(shì)與HSP-70變化一致。具體結(jié)果見(jiàn)表3、4和圖2。

2.4相關(guān)性分析 腦出血組大鼠NSS評(píng)分與HSP70表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511，P<0.05)，HSP70與P-JAK2、P-STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.790，P<0.05；r=0.447，P<0.05)。

3討論

JAK/STAT信號(hào)通路根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為兩類(lèi)[8]：一類(lèi)是JAK家族，其本質(zhì)是一組蛋白酶,相對(duì)分子質(zhì)量120 000～130 000之間，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2；另一類(lèi)是在研究干擾素時(shí)發(fā)現(xiàn)的STAT家族，是位于染色體內(nèi)的一組轉(zhuǎn)錄因子，相對(duì)分子量約4 000～113 000，約由750～850個(gè)氨基酸構(gòu)成，是JAK的下游底物，包括STAT1-4，STAT5a、b和STAT6。JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)是指信使物質(zhì)遇到細(xì)胞外的刺激時(shí)，識(shí)別并結(jié)合于胞膜的受體誘導(dǎo)其在胞漿內(nèi)形成JAK2結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合后JAK2發(fā)生磷酸化并暴露STAT3的錨定點(diǎn)，STAT3磷酸化而活化并移向胞核內(nèi)，完成與目的基因的信號(hào)傳導(dǎo)和表達(dá)調(diào)控[9]。由此可知，JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在JAK2與STAT3發(fā)生磷酸化后實(shí)現(xiàn)，因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達(dá)，可以了解JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化情況。徐海發(fā)等[1]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織P-JAK2、P-STAT3表達(dá)增多，JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，其可能參與腦損傷的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P-JAK2和P-STAT3在腦出血組中表達(dá)明顯較正常組和假手術(shù)組高，表明腦出血時(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活。AG-490是一種選擇性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化的抑制劑, 可有效阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活化, 進(jìn)而阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P-JAK2和P-STAT3在AG-490組表達(dá)較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，表明AG-490能有效地阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路。除此之外，AG-490能影響人的多項(xiàng)生命活動(dòng)，如可顯著縮小腦梗死面積, 減少細(xì)胞凋亡, 改善神經(jīng)功能缺損[11]；亦可抑制骨髓瘤淋巴細(xì)胞細(xì)胞的增殖, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[3]。

表 1　各組大鼠造模成功后不同時(shí)間NSS評(píng)分比較

注：NNS：神經(jīng)功能缺損評(píng)分；AG-490：α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺，表2～4同；分別與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與組內(nèi)其他時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05

表 2　各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)HSP70表達(dá)的累積光密度值±s，n=5)

注：HSP-70：熱休克蛋白70；分別與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；-：表示未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

A:組正常；B：假手術(shù)組；C:腦出血組；D:AG-490干預(yù)組；箭頭所示為HPS70陽(yáng)性細(xì)胞

圖1各組大鼠造模成功后48 h血腫周?chē)鶫SP70陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(免疫組化染色×400)

表 3　各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)P-JAK2表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較±s，n=5)

注：P-JAK2：磷酸化蛋白酪氨酸激酶2；與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；-：表示未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表 4　各組大鼠造模成功后不同時(shí)間點(diǎn)P-STAT3表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較±s，n=5)

注：P-STAT3：磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；與正常組、假手術(shù)組比較，aP<0.05；與腦出血組比較，bP<0.05；與其他時(shí)間點(diǎn)比較，cP<0.05；-：表示未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

圖2各組大鼠血腫周?chē)鶳-JAK2(A)和P-STAT3(B)表達(dá)(Western blotting)

HSP是指細(xì)胞在應(yīng)激原和高溫誘導(dǎo)下生成的一類(lèi)具有高度保守性的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量在80 000～110 000、68 000～74 000和18 000～30 000之間，可分為HSP110、HSP70、HSP60和小分子量HSP等幾個(gè)家族。當(dāng)細(xì)胞在受到某些不利因素，如高熱、感染、缺血、缺氧及化學(xué)物質(zhì)等刺激時(shí)，HSP70會(huì)迅速短暫地大量合成而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能。相關(guān)研究結(jié)果顯示HSP70具有神經(jīng)功能保護(hù)作用[12-13]，其機(jī)制包括：(1)分子伴侶作用，HSP70能對(duì)抗內(nèi)源性損傷因子引起的毒性作用，清除細(xì)胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)，減輕損傷及應(yīng)激反應(yīng)引起的細(xì)胞膜蛋白的變性，保護(hù)腦組織細(xì)胞的蛋白；(2)減少氧自由基釋放, 穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體, 防止蛋白質(zhì)變性；(3)抑制細(xì)胞因子的炎性反應(yīng)，起一定的非特異性免疫保護(hù)作用；(4)抗凋亡作用，凋亡是腦組織缺血低氧性損傷后的主要病理改變，Kitamura等[14]研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路是導(dǎo)致創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要途徑，而HSP70是其中的一種抑制分子。劉勝中等[15]研究表明：心臟經(jīng)停搏液處理后,心肌組織中HSP70表達(dá)明顯增加；同時(shí)加用AG-490阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路后,HSP70表達(dá)降低，凋亡心肌細(xì)胞增加，提示心臟停搏液可能通過(guò)JAK2/STAT3途徑，激活STAT3，上調(diào)HSP70表達(dá)，調(diào)動(dòng)心臟內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：AG-490組NSS評(píng)分較假手術(shù)組低，較腦出血組高，P-JAK2、P-STAT3、HSP70的表達(dá)較假手術(shù)組高，而較腦出血組低，且P-JAK2、P-STAT3與HSP70的表達(dá)呈正相關(guān)，表明在SD大鼠造模后腹腔注射通道阻斷劑AG-490，可下調(diào)HSP70在大鼠血腫周?chē)谋磉_(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，此作用可能由JAK2/STAT3途徑介導(dǎo)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，大鼠腦出血時(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活，血腫周?chē)X組織HSP70表達(dá)增多，而JAK2/STAT3通道阻滯劑AG-490干預(yù)可使大鼠神經(jīng)功能缺損減輕，降低大鼠腦組織血腫周?chē)鶳-JAK2、P-STAT3、HSP70的表達(dá)，且P-JAK2、P-STAT3與HSP70的表達(dá)呈正相關(guān)，提示JAK2/STAT3信號(hào)通路可能通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)進(jìn)而對(duì)大鼠腦出血后起神經(jīng)保護(hù)作用，此研究可為進(jìn)一步明確腦出血后腦組織損傷機(jī)制及治療提供新的線索。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

The neuroprotective effect of heat shock protein 70 through the JAK2/STAT3 signaling pathway in cerebral hemorrhage

YUANZhijun,LIXiaogang,HEXiaoying*.

*DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofSichuanMedicalCollege,LuzhouSichuan646000,ChinaCorresponding author: HE Xiaoying, Email: 102050228@qq.com

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of Alpha cyano-(3-hydroxy) N-styrene benzyl amine (AG-490) [the janus kinase 2-signal transducer and activator of transcription 3(JAK2/STAT3) signaling pathways specific antagonist] on the expression of heat shock protein 70 (HSP70), phosphorylated janus kinase 2( P-JAK2) and activator of transcription 3(P-STAT3) in cerebral hemorrhage rat models, and the correlation between the JAK2/STAT3 signaling pathway and the expression of HSP70. To investigate the role of JAK2/STAT3 signal pathway and HSP70 in neuroprotective effects of cerebral hemorrhage rats. MethodsOne hundred healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: the normal group, the sham operation group, the cerebral hemorrhage group and the AG-490 group. The autologous arterial blood was stereotaxically injected to the right caudate nucleus to establish cerebral hemorrhage rat models. According to the different sacrificed time, every group was divided into 5 subgroups: 6 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d. The rats were evaluated by the neurological deficit scores (Neurological Severity Scores, NSS), the expressions of HSP70, P-JAK2, and P-STAT3 were detected by immunostaining and Western blot using rat brain tissue around the hematoma. ResultsHSP70, P-JAK2 and P-STAT expressions in the cerebral hemorrhage group and the AG-490 group were higher than those of the sham group and the normal group (P<0.05), and 48 h after modeling their expressions reached a peak (P<0.05). HSP70, P-JAK2 and P-STAT expressions in the AG-490 group were lower than those of the cerebral hemorrhage group (P<0.05). NSS and HSP70 expression were negatively correlated (r=-0.511, P<0.05), HSP70 expression was positively correlated with P-JAK2 and P-STAT3 expression (r=0.790, P<0.05; r=0.447, P<0.05) in the cerebral hemorrhage group. ConclusionsJAK2/STAT3 signaling pathway may play a role in neuroprotection after cerebral hemorrhage by upregulating the expression of HSP70.

Key words:cerebral hemorrhage; HSP70 heat-shock proteins; janus kinase 2；STAT3 transcription factor

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.004

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(110368)

通訊作者：何曉英，Email:l02050228@qq.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R744.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2963 (2016)01-0014-05

(收稿日期：2015-04-02)