東莞市屠宰場(chǎng)環(huán)境及屠宰豬體內(nèi)致病性大腸桿菌的分離與鑒定

徐振娜，洪偉彬，李永福，鐘群芳，劉　芳（廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞523086）

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東莞市屠宰場(chǎng)環(huán)境及屠宰豬體內(nèi)致病性大腸桿菌的分離與鑒定

徐振娜，洪偉彬，李永福，鐘群芳，劉芳
（廣東省東莞市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東東莞523086）

大腸桿菌（E.coli）為埃希菌屬（Escherichia）代表菌。為人和動(dòng)物腸道中的常在菌，在其被發(fā)現(xiàn)的很長一段時(shí)間內(nèi)，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，統(tǒng)稱為致病性大腸桿菌。根據(jù)不同的生物學(xué)特性，將致病性大腸桿菌分為5類：腸致病性大腸桿菌（ETEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸黏附性大腸桿菌（EAEC）。其中EHEC由于毒力強(qiáng)、致病性高而受到廣泛關(guān)注。目前大腸桿菌已成為食源性疾病的重要病原之一，食品污染是導(dǎo)致大腸桿菌疫情最常見的原因。2011年，德國由食用毒蔬菜引發(fā)的出血性腸炎暴發(fā)疫情。包括德國在內(nèi)的歐盟與歐洲經(jīng)濟(jì)區(qū)成員國通報(bào)的病例數(shù)達(dá)4 023例，其中并發(fā)溶血性尿毒綜合征（HUS）病例885例，非HUS病例3 138例，死亡48例［1］。

我國是豬肉生產(chǎn)消費(fèi)大國，豬肉一直在我國大多數(shù)地區(qū)居民肉禽類消費(fèi)結(jié)構(gòu)中占據(jù)絕大的比重。我市每天有1萬多頭生豬經(jīng)屠宰場(chǎng)屠宰后流向市民餐桌，生豬待宰和屠宰的過程極易受到致病性大腸桿菌的污染，而市民吃了這些被污染的豬肉容易引起食物中毒，因此屠宰場(chǎng)地環(huán)境及屠宰豬的致病性大腸桿菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)非常有必要。本試驗(yàn)采集東莞市32個(gè)鎮(zhèn)街生豬屠宰場(chǎng)的環(huán)境、污水和屠宰豬體內(nèi)樣品，進(jìn)行致病性大腸桿菌的分離鑒定。通過全市范圍內(nèi)的摸底調(diào)查，得到東莞市致病性大腸桿菌的感染流行情況的可靠數(shù)據(jù)，為監(jiān)管部門制定下一步防控措施提供參考。

1　材料與方法

1.1材料伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂、革蘭染色液、大腸桿菌IMVC生化鑒定盒、致瀉大腸埃希菌生化鑒定盒、大腸埃希菌O157：H7生化鑒定盒、血平板、90 mm玻璃培養(yǎng)皿等，均購自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；腸道致病性大腸埃希菌診斷血清、腸道侵襲性大腸埃希菌診斷血清、腸道產(chǎn)毒性大腸埃希菌診斷血清、大腸埃希菌H7診斷血清等，均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；大腸桿菌O157：H7熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購自深圳太太基因工程有限公司。超凈工作臺(tái)，生物安全柜，離心機(jī)，顯微鏡。

1.2樣品每個(gè)屠宰場(chǎng)豬肝樣品10份（共320份）；污水水樣3份（共96份）；環(huán)境空氣5份（共160份）；屠宰用具、工作臺(tái)、地板等涂抹拭子3份（共96份）。

1.3采樣方法

1.3.1豬肝豬屠宰后，無菌采集豬肝樣品100 g，冷藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室待檢。

1.3.2空氣樣品采用沉降法。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)的大小，選擇有代表性的位置作為環(huán)境空氣細(xì)菌檢測(cè)的采樣點(diǎn)。室內(nèi)面積不超過30 m2，在對(duì)角線上設(shè)里、中、外3點(diǎn)；室內(nèi)面積超過30 m2，設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，即室內(nèi)墻角對(duì)角線交點(diǎn)為1個(gè)采樣點(diǎn)，該交點(diǎn)與四墻角連線的中點(diǎn)為另外4個(gè)采樣點(diǎn)。

將已制備好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平皿置采樣點(diǎn)，放置時(shí)需離地0.8～1.5 m，遠(yuǎn)離墻壁1 m以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露30 min，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。

1.3.3污水樣品以滅菌后的10 mL EP管在每個(gè)屠宰場(chǎng)分3個(gè)點(diǎn)采污水，每個(gè)點(diǎn)10 mL左右。

1.3.4場(chǎng)地及器具以高壓滅菌后的棉拭子反復(fù)在屠宰器具、工作臺(tái)、地板等表面檫拭，然后將帶菌棉簽放入裝有10 mL生理鹽水的EP管中，充分振蕩后冷藏備用。

1.4細(xì)菌分離

1.4.1肝臟樣品無菌取肝臟樣品25 g進(jìn)行前增菌，具體方法參考GB/T4789.6-2003。同時(shí)取可疑菌落劃線接種于大腸桿菌O157：H7顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.4.2空氣樣品在普通瓊脂平皿中選取圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、隆起菌落接種于前增菌肉湯，具體方法參考GB/T4789.6-2003。同時(shí)劃線接種于大腸桿菌O157：H7顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。觀察平板上生長的菌落。

1.4.3水樣及器具拭子取1 mL水樣或拭子液進(jìn)行前增菌，具體方法參考GB/T4789.6-2003。同時(shí)取可疑菌落劃線接種于大腸桿菌O157：H7顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。

1.4.4細(xì)菌鑒定挑取平板上的可疑菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，并進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)。具體方法參考GB/T4789.6-2003。

1.4.5腸出血性大腸桿菌O157分離鑒定取前增菌菌液1 mL用裂解法提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每反應(yīng)管加PCR反應(yīng)液22.5 μL，Taq酶0.5 μL，UNG 酶0.06 μL，模板2 μL。熒光PCR反應(yīng)程序：37℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃，3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，60℃40 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25 μL。熒光信號(hào)設(shè)為FAM熒光素。取熒光PCR陽性樣品菌液1環(huán)劃線接種大腸桿菌O157顯色平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，挑取可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

1.5血清型鑒定按照寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌分離挑取在伊紅美藍(lán)平板上呈深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落和在大腸桿菌O157顯色平板上呈紫紅色、扁平透明、邊緣光滑、直徑約2 mm的可疑菌落進(jìn)行革蘭染色。經(jīng)革蘭染色、鏡檢可見革蘭陰性、散在或成對(duì)排列、兩端鈍圓的短桿菌。

2.2大腸桿菌O157生化鑒定挑取熒光PCR陽性的菌液劃線接種于顯色培養(yǎng)基，培養(yǎng)后挑取顯色培養(yǎng)基上的可疑菌落進(jìn)行生化鑒定（表1），符合以下生化反應(yīng)的菌株再進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，共分離到78株大腸桿菌O157：H7，具體結(jié)果見表2。

表1　大腸桿菌O157的生化特征

表2　腸出血性大腸桿菌O157：H7分離鑒定結(jié)果

2.3其他致病性大腸桿菌的分離與鑒定通過生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)，共分離到其他致病性大腸桿菌70株，具體結(jié)果見表3。

表3　其他致病性大腸桿菌分離鑒定結(jié)果

2.4血清型鑒定通過玻板凝集試驗(yàn)，其中60株致病性大腸桿菌的血清型分屬于12個(gè)血清型。其中O138、O9、O8為主要血清型，另有10株未定型。具體結(jié)果見表4。

表4　致病性豬大腸桿菌O抗原血清型鑒定結(jié)果

3　討論

鑒于致病性大腸桿菌對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及人類健康的嚴(yán)重危害性，本研究從屠宰場(chǎng)屠宰豬及外環(huán)境采樣，進(jìn)行致病性大腸桿菌的分離與鑒定。共分離到腸出血性大腸桿菌O157：H778株，其他致病性大腸桿菌70株，其中O138、O9、O8為主要血清型。從結(jié)果來看，無論是在屠宰豬還是屠場(chǎng)的周圍環(huán)境、空氣等，大腸桿菌O157：H7及其他致病性大腸桿菌都普遍存在。

在所有的致病性大腸桿菌中，以腸出血性大腸桿菌O157：H7的毒力最強(qiáng)，也最受人們關(guān)注，因此本研究對(duì)其進(jìn)行單獨(dú)的分離鑒定。從屠宰場(chǎng)及外環(huán)境等樣品中共分離到大腸桿菌O157：H778株，陽性率為11.2%，其中屠宰場(chǎng)陽性率最高，為16.2%；污水中陽性率最低，為5.2%。近幾年來，我們對(duì)大腸桿菌O157：H7一直都有監(jiān)測(cè)。黃育浩等使用熒光PCR的方法對(duì)東莞市屠宰豬O157：H7污染情況進(jìn)行調(diào)查，2007-2009年平均陽性率23.61%［2］。曾毅等對(duì)南寧市2008-2012年大腸桿菌O157：H7進(jìn)行監(jiān)測(cè)，平均陽性率為0.38%［3］。倪大新等隨后對(duì)江蘇省大腸桿菌O157：H7在宿主動(dòng)物中的帶菌率及菌株毒力情況進(jìn)行了檢測(cè)，從6個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)共采集豬、雞、羊、牛等家畜家禽糞便樣本1 767份，共檢出大腸桿菌O157：H7170株，總帶菌率為9.62%［4］。與其他省市相比，東莞市的O157：H7的檢出率一直偏高。一方面可能跟采樣的環(huán)境有關(guān)，屠宰場(chǎng)環(huán)境狹小，在很短的時(shí)間內(nèi)要屠宰大量的豬，可能會(huì)導(dǎo)致污染的情況發(fā)生；另一方面也說明東莞市的大腸桿菌O157：H7有暴發(fā)流行的危險(xiǎn)。

除腸出血性大腸桿菌O157：H7外，其他的致病性大腸桿菌也都普遍存在于屠宰豬體內(nèi)及外環(huán)境中。本試驗(yàn)共分離到其他致病性大腸桿菌70株，其中腸產(chǎn)毒性大腸桿菌20株，腸道致病性大腸桿菌42株，腸侵襲性大腸桿菌8株。以血清型O138、O9、O8為主要流行株，占所有菌株的45.5%。大腸桿菌血清型眾多，不僅不同地區(qū)有不同的優(yōu)勢(shì)菌株，而且同一地區(qū)在不同的時(shí)間也會(huì)有不同的優(yōu)勢(shì)菌株。趙恒章等對(duì)豫北地區(qū)的致病性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，其主要流行血清型為O101，O60，O141［5］，O139。姜衛(wèi)東等報(bào)道，O119、O60、O75、O141、O20、O8為廣東省豬大腸桿菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型［6］。10年后，蘇丹萍等對(duì)廣東地區(qū)部分豬場(chǎng)的致病性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)O138、O9為優(yōu)勢(shì)血清型。占分離菌株的37.93%［7］。高云英等報(bào)道，陜西省豬大腸桿菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型為O139、O101、O149、O141、O60［8］。由此可見地區(qū)間致病性大腸桿菌血清型分布差異較大，需要定期對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，掌握流行情況。

我們先通過熒光PCR的方法進(jìn)行初步篩選，陽性樣品進(jìn)行下一步分離鑒定，并最終根據(jù)細(xì)菌分離鑒定確定結(jié)果。熒光PCR的陽性率比細(xì)菌分離鑒定的陽性率要高，這跟其方法的特點(diǎn)有關(guān)。熒光PCR技術(shù)以其快速、敏感的特點(diǎn)在臨床上廣泛應(yīng)用，但高敏感性也使其有假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)菌分離鑒定雖然耗時(shí)長，工作量大，但是假陽性較少。我們將這兩種方法結(jié)合，既減少工作量，又提高了工作效率。

致病性大腸桿菌是一種人畜共患病病原菌，可通過污染的食物和水等引起暴發(fā)流行。本次調(diào)查結(jié)果表明，屠宰豬及屠宰場(chǎng)的環(huán)境、污水、場(chǎng)地和器具都受到不同程度的污染，防控形勢(shì)嚴(yán)峻。本試驗(yàn)的結(jié)果為監(jiān)管部門研究進(jìn)一步的防控措施、制定用藥方案奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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［7］蘇丹萍，趙彥宗，陳敏鴻，等.廣東地區(qū)部分豬場(chǎng)大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（7）：80-82.

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中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0101- 03

收稿日期：2014-05-15

基金項(xiàng)目：東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012108102053）

作者簡介：徐振娜（1987-），女，助理獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病防治，E-mail：57995344@qq.com