北京地區(qū)犬細小病毒流行特性分析

張偉偉，張兆霞，孫艷爭，于詠蘭（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

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北京地區(qū)犬細小病毒流行特性分析

張偉偉，張兆霞，孫艷爭，于詠蘭
（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193）

摘要：為了解北京地區(qū)犬細小病毒（CPV）流行特性，采用PCR技術(shù)對1 209份犬糞便進行CPV檢測。對獲得的犬細小病毒的VP2片段進行擴增后再測序分析，并對感染犬的轉(zhuǎn)歸進行跟蹤回訪。結(jié)果表明，CPV陽性樣本232份（19.2%），其中CPV-2a占62.1%，CPV-2b占37.9%，未發(fā)現(xiàn)CPV-2和CPV-2c。CPV-2b較CPV-2a更易感染0～3月齡犬（P＜0.05），且CPV-2b感染犬死亡率顯著高于CPV-2a感染犬（P＜0.05）。

關(guān)鍵詞：犬細小病毒（CPV）；VP2；死亡率

犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）為無囊膜單股DNA病毒。目前世界各地犬群中流行的犬細小病毒抗原型主要包括CPV-2a、CPV-2b及CPV-2c，有研究表明，CPV突變株較原始CPV-2毒株致病力更強、宿主范圍更廣［1-2］。關(guān)于CPV-2a、CPV-2b及CPV-2c之間的差異性的研究，目前還很少。為了解北京地區(qū)CPV流行情況，比較北京地區(qū)CPV-2a及CPV-2b的流行特性，本試驗對1 209份犬糞便進行CPV檢測，并對檢測出的232份糞便中的CPV進行分型，對臨床感染病例進行了跟蹤回訪，為進一步研究比較CPV-2a及CPV-2b的致病性提供參考。

1　材料與方法

1.1糞便樣本2012-2013年間于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院采集到糞便1 209份。

1.2試劑2xPCR Super TaqMix、DL-2 000 Plus Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3引物以CPV-b（Gen Bank accession no.M38248）為參考，設(shè)計能夠同時擴增出CPV基因組3909、4062 及4064多態(tài)性基因位點的引物。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

上游引物A：5′-TTGAGGCGTCTACACAAGGG-3′

下游引物B：5′-GGATTCCAAGTATGAGAGGCTC-3′

1.4模板制備煮沸法［3］：取臨床收集糞便樣本100 μL與900 μL生理鹽水混合，1 157 r/min離心10 min，取上清液；對上清液進行沸水浴10 min，冰浴10 min，18 514 r/min離心10 min，取上清，用無菌雙蒸水做1∶10倍稀釋，作為PCR反應(yīng)模板。

1.5PCR擴增反應(yīng)體系25 μL：2xPCR Taq Mix 12.5 μL、上、下游引物（0.01 mol/L）各1 μL、DNA模板5 μL、無菌雙蒸水5.5 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)，95℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6PCR產(chǎn)物測序PCR產(chǎn)物送至北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行擴增片段的核苷酸序列測定。

1.7糞便中CPV檢測利用1.4、1.5中介紹的方法對收集到的糞便樣本進行CPV檢測，對陽性樣本中的CPV的VP2片段進行核苷酸序列測定，并與參考毒株CPV-2（GenBank accession no.M38245）進行比對，根據(jù)相似度，判定其是否為CPV。

1.8CPV分型利用DANStar軟件的Editseq模塊將所得核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，再利用MegAlign模塊，將氨基酸序列與參考毒株CPV-2 （GenBank accession no.M38245）、CPV-2a（M24003）、CPV-2b（M74849）及CPV-2c（FJ222821）進行比對，比較CPV的VP2 375位點及426位點對應(yīng)的氨基酸差異，進行分型。

1.9CPV流行特性分析根據(jù)病毒分型結(jié)果及采集到的樣本信息，按照性別、年齡、免疫狀況進行分組。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對不同抗原型病毒流行情況進行分析比較。

2　結(jié)果

2.1CPV陽性率經(jīng)檢測1 209份犬糞便樣本中，CPV陽性樣本232份，CPV陰性樣本977份，陽性率19.2%。

2.2不同抗原型CPV分布狀況CPV分型結(jié)果表明：144份（62.1%）為CPV-2a，88份（37.9%）為CPV-2b，未發(fā)現(xiàn)CPV-2及CPV-2c。

2.3CPV-2a及CPV-2b感染犬群性別組成分析

CPV-2a感染的犬群與CPV-2b感染的犬群，性別組成無顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1　不同抗原型CPV感染犬群性別組成

2.4CPV-2a及CPV-2b感染犬群年齡組成分析

對感染CPV-2a和CPV-2b的犬群進行年齡組成分析，經(jīng)卡方檢驗P＜0.05，兩犬群年齡組成上存在顯著差異。由表2可知，兩種抗原型CPV均易感染0～3月齡犬，并且CPV-2b比CPV-2a更易感染該年齡段的幼犬。

表2　不同抗原型感染犬群年齡分布

2.5CPV-2a及CPV-2b感染犬免疫狀況分析本試驗根據(jù)免疫狀況將感染犬群分為完全免疫、不完全免疫及未免疫3組，其中完全免疫是指按照推薦的免疫程序進行了免疫，未完全免疫是指進行了免疫但是未完成完整的免疫程序，例如只注射了1次或2次疫苗，未免疫是指完全沒有注射過疫苗［4］。對CPV-2a和CPV-2b感染的犬群的免疫狀況進行分析，結(jié)果見表3，CPV-2a感染的犬群中完全免疫犬占20.1%，其他均為不完全免疫犬和未免疫犬。而CPV-2b感染的犬群中完全免疫犬也只占到了20.5%，對兩組犬群中不同免疫狀況犬的分布情況進行比較，卡方檢驗P＞0.05，二者無顯著差異。綜上，兩種抗原型CPV均易感染不完全免疫犬和未免疫犬。

表3　不同抗原型CPV感染犬群免疫狀況

2.6CPV-2a及CPV-2b感染犬治愈率比較為了進一步了解CPV-2a與CPV-2b感染犬的轉(zhuǎn)歸情況，對感染犬進行回訪，可獲得確切轉(zhuǎn)歸的CPV-2a感染犬78例，CPV-2b感染犬44例。結(jié)果見表4，由表4可知CPV-2b感染的犬死亡率為61.4%，而CPV-2a感染的犬死亡率僅為33.3%，經(jīng)卡方檢驗，P＜0.05，說明感染不同抗原型CPV犬死亡率存在顯著差異。

表4　不同抗原型CPV感染犬治愈率

3　討論

本研究首次對北京地區(qū)流行的不同抗原型CPV的流行特性進行了比較。2012-2013年間北京地區(qū)犬群CPV感染率與2011-2012年相比有所上升，并且仍處于較高的水平［5］。本次試驗所獲得CPV陽性樣本中CPV-2a占62.1%，CPV-2b占37.9%，未發(fā)現(xiàn)CPV-2及CPV-2c，這與我國各地流行病學(xué)調(diào)查相符，目前我國以CPV-2a和CPV-2b為主要流行毒株，并且CPV-2a所占比例高于CPV-2b［5-8］。

統(tǒng)計分析表明：CPV-2a感染的犬群和CPV-2b感染的犬群在性別組成上無顯著差異。CPV-2b感染的犬群中0～3月齡犬所占比例顯著高于CPV-2a感染的犬群中0～3月齡犬所占比例，這說明CPV-2b較CPV-2a更易感染該年齡段的犬。感染犬群中0～3月齡犬所占比例較高，這是由于幼犬在4～12周齡時，母源抗體逐漸下降到保護效價（HI≥1∶80）以下，此時幼犬針對CPV的獲得性免疫還未建立，處于免疫空白期，因此這一時期的幼犬更易感染CPV［9］。

對CPV-2a及CPV-2b感染的犬群的免疫狀況進行分析，相對于完全免疫犬，兩組犬群中不完全免疫犬及未免疫犬占有較高的比例。目前臨床應(yīng)用的疫苗大多為CPV-2弱毒株疫苗，雖然相關(guān)試驗已經(jīng)證明，弱毒株疫苗可以使犬產(chǎn)生有效的免疫力，但是CPV本身一直處于不斷的變異中，有可能導(dǎo)致免疫失敗的發(fā)生［10-11］。

不同抗原型CPV感染犬后，犬死亡率有顯著差異，該結(jié)果對于犬感染CPV后的預(yù)后有很重要的提示意義。本研究發(fā)現(xiàn)CPV-2b感染的犬死亡率高于CPV-2a感染的犬，這與Moon等人的研究結(jié)果有所差異，但是關(guān)于病毒毒力與流行性關(guān)系的研究指出，自然選擇傾向于降低病毒的毒力，因為只表現(xiàn)出輕微臨床癥狀或者無臨床癥狀的宿主可以有效地傳播病毒，這一理論很好地解釋了CPV-2a的致死率低于CPV-2b，流行率卻高于CPV-2b［12-13］。

綜上所述，北京地區(qū)流行CPV抗原型毒株主要為CPV-2a和CPV-2b，且兩種毒株流行特性上存在一定的差異：CPV-2b較CPV-2a更易感染0～3月齡犬，且CPV-2b感染犬死亡率高于CPV-2a感染犬。

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Epidemiological features of Canine Parvovirus（CPV）in Beijing，China

ZHANG Wei-wei，ZHANG Zhao-xia，SUN Yan-zheng，YU Yong-lan
（College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

Abstract：A total of 1209 canine fecal samples were detected by PCR for CPV.The sequences of the PCR products were compared with the reported CPV isolates in GenBank to analyze the epidemiological features of CPV in Beijing，China.Clinical reviews of infected dogs were also carried out.The results showed that 232（19.2%）samples were positive for CPV.62.1%of viruses were CPV-2a and 37.9%were CPV-2b.CPV-2 and CPV-2c were not found.Compared with CPV-2a，CPV-2b tended to infect younger puppies（0～3 month-old）and the mortality rate of dogs infected by CPV-2b was significantly higher than dogs infected by CPV-2a（P＜0.05）.

Key words：canine parvovirus（CPV）；VP2；mortality rate

中圖分類號：S852.65+9.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0082- 03

收稿日期：2014-12-22

基金項目：中農(nóng)大動物醫(yī)院科研基金

作者簡介：張偉偉（1987-），女，碩士，主要從事小動物病毒病研究，E-mail：zhangweiweidream@126.com

通訊作者：于詠蘭，E-mail：yylpurple@126.com；孫艷爭，E-mail：sunyanzheng2580@163.com

Corresponding authors：YU Yong-lan；SUN Yan-zheng