預(yù)防用自擬復(fù)方中藥對大腸桿菌感染早期小鼠免疫功能的影響試驗

王　嬋，左之才，余樹民，鄧義貞，茍麗萍，肖越峰（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川雅安625014）

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預(yù)防用自擬復(fù)方中藥對大腸桿菌感染早期小鼠免疫功能的影響試驗

王嬋，左之才，余樹民，鄧義貞，茍麗萍，肖越峰
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室，四川雅安625014）

摘要：將96只小鼠隨機分為4組，Ⅰ、Ⅱ組生理鹽水灌胃，Ⅲ組復(fù)方中藥灌胃，Ⅳ組黃芪多糖灌胃，連續(xù)3 d；試驗第4天，Ⅰ組注射生理鹽水；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液。在感染后第3小時、第6小時、第10小時采集小鼠血樣及血清，分別測定其血液生理指標(biāo)（WBC、GRA、LYM及MID）及細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ）的變化。結(jié)果自擬復(fù)方中藥具有提高小鼠外周血的WBC（尤其是LYM、MID）；促進IL-6分泌，抑制TNF-α、IL-10分泌，使Th2向Th1細(xì)胞漂移，促進腹腔注射大腸桿菌早期小鼠Th2/Th1細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡的作用。

關(guān)鍵詞：復(fù)方中藥；大腸桿菌；小鼠；血液生理指標(biāo)；細(xì)胞因子

在現(xiàn)代集約化畜禽養(yǎng)殖中化學(xué)藥品的濫用、環(huán)境污染，以及一些感染性疾病等因素均可引起動物骨髓產(chǎn)生抑制而使造血功能和免疫功能降低誘發(fā)各類疾病，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害。中草藥可以通過影響機體外周白細(xì)胞的數(shù)量以及細(xì)胞因子的分泌達到增強機體免疫功能的作用。單藥如黃芪通過增加健康小鼠及骨髓抑制小鼠的白細(xì)胞總數(shù)（WBC），抑制膿毒癥大鼠腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-4的表達促進干擾素IFN-γ的表達發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)機能［1-3］。如復(fù)方白頭翁湯具增加小鼠的WBC，并且能提高淋巴細(xì)胞（LYM）的增殖能力［4］；玉屏風(fēng)散具有增加表虛征候小鼠的WBC、LYM及淋巴細(xì)胞百分比（LYM%）的作用［5］。

現(xiàn)代養(yǎng)殖中常以中醫(yī)“治未病”理論為指導(dǎo)，為防止在各種應(yīng)激引起畜禽發(fā)生疾病常采取預(yù)防性用藥。以清熱解毒、燥濕健脾、補血和血為原則的中藥復(fù)方，能明顯改善環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠的血液生理指標(biāo)，并通過細(xì)胞因子IL-2、IL-4等發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用，其中以10 g/kg體重劑量應(yīng)用效果最佳［6-7］。為進一步探討該復(fù)方中藥在早期預(yù)防感染、調(diào)節(jié)機體免疫功能過程中的作用，開展本試驗研究。

1　材料與方法

1.1試驗藥物自擬中藥復(fù)方由魚腥草、蒲公英、陳皮、蒼術(shù)、白芍、白術(shù)、當(dāng)歸、白頭翁、大青葉、茯苓、甘草、黃柏、黃芪、連翹等14味中草藥組成，制備見參考文獻［6］。黃芪多糖注射液（10 mL含0.1 g）成都乾坤動物藥業(yè)有限公司，批號：20130609。

1.2試驗菌株及菌液配制大腸桿菌（vmzs E.coli）從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)內(nèi)科實驗室保存。該菌對昆明系小鼠的LD0為1.7×107CFU［8］。將vmzs E.coli復(fù)壯并接種于5 mL MH肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16～18 h，測定其OD值，估算其菌液濃度，再用平板菌落計數(shù)法將菌液濃度稀釋至約為1.7×108CFU/mL，備用。

1.3實驗動物清潔級昆明系小鼠100只，6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心。

1.4主要試劑和儀器小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 ELISA檢測試劑盒，均購自武漢基因美生物科技有限公司，批號：Lot.201303；全自動血球分析儀（ABACUS Junior Vet瑞士），全自動熒光酶標(biāo)分析儀（PR-521）。

1.5實驗動物分組與處理選取96只小鼠隨機分為4組，每組24只。I組（健康對照組）；Ⅱ組（感染組）生理鹽水灌胃；Ⅲ組（復(fù)方中藥組）復(fù)方中藥灌胃（劑量為10 g/kg；相當(dāng)于生藥含量）；Ⅳ組（對照藥物組）黃芪多糖灌胃（66 mg/kg體重）。各組均按每10 g體重灌服0.1 mL，1次/d，連續(xù)3 d；試驗第4天上午8：00，I組腹腔注射0.1 mL生理鹽水，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組腹腔注射0.1 mL菌液。各組按常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.6檢測指標(biāo)及方法在感染后3、6、10 h時，每組各隨機選取8只小鼠，雌雄各半，眼球摘除取血1 mL，其中0.3 mL用EDTA-K2抗凝后用ABACUS Junior Vet測定小鼠血液生理指標(biāo)，包括WBC、GRA、LYM、MID等。剩余血液分離血清，用PR-521檢測小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10的含量。

1.7數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.0軟件進行方差分析數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”表示。P≤0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2　結(jié)果

2.1小鼠腹腔注射大腸桿菌前后的臨床癥狀

各組小鼠精神良好，反應(yīng)靈敏，飲、食欲正常。注射大腸桿菌后，Ⅱ組小鼠逐漸出現(xiàn)精神抑制、活動減少、蜷縮等癥狀；注射后3 h，多數(shù)小鼠的飲、食欲明顯減少，喜扎堆；6 h左右，部分小鼠精神高度沉郁，出現(xiàn)呼吸急促，眼睛分泌物增多等癥狀；10 h后，小鼠病情基本穩(wěn)定，與6 h觀察癥狀相似。而Ⅲ、Ⅳ組的小鼠，除部分在3 h～6 h出現(xiàn)精神稍差、活動減少外，沒有表現(xiàn)其他異常癥狀；在10 h后，小鼠的精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常。I組小鼠精神良好，反應(yīng)靈敏，飲、食欲均正常。各組小鼠均無死亡。

2.2注射大腸桿菌早期小鼠的血液生理指標(biāo)變化見圖1。與I組比較，Ⅱ組小鼠3、6、10 h的WBC、GRA、LYM及LYM%、MID及MID%均顯著降低（P＜0.05），GRA%在10 h顯著升高。

圖1　小鼠血液生理指標(biāo)的變化注：各組同一時間點比較，大寫字母不同表示差異顯著（P≤0.05），下圖同

2.3注射大腸桿菌早期小鼠的細(xì)胞因子變化，見圖2。Ⅱ組小鼠3、6、10 h的TNF-α、IL-10、IFN-γ含量及IL-10/IFN-γ比值，以及6、10 h的IL-6含量較I組顯著升高（P＜0.05）。Ⅱ組小鼠3 h的IL-10含量及IL-10/IFN-γ比值顯著高于6、10、3 h的TNF-α含量顯著高于10 h（P＜0.05）；而3 h的IFN-γ含量顯著低于10 h（P＜0.05）。I組小鼠各時間點的指標(biāo)間變化不明顯。

圖2　小鼠血液細(xì)胞因子的變化

2.4使用復(fù)方中藥及黃芪多糖小鼠的血液生理指標(biāo)變化，見圖1。與Ⅱ組比較，Ⅲ組小鼠3、6、10 h的LYM、MID，3、6 h的WBC以及3 h的MID%、10 h的LYM%顯著升高（P＜0.05）；10 h的GRA%顯著降低（P＜0.05）。Ⅳ組小鼠3、6、10 h的 WBC、GRA、MID，6、10 h的LYM，3、6 h的MID% 及6 h的GRA%，顯著高于Ⅱ組（P＜0.05）。

2.5使用復(fù)方中藥及黃芪多糖小鼠的細(xì)胞因子變化，見圖2。Ⅲ組小鼠3、6、10 h的TNF-α、IL-10含量以及6、10 h的IL-10/IFN-γ比值較Ⅱ組顯著降低（P＜0.05）。Ⅲ組小鼠3h的IL-10含量及IL-10/IFN-γ比值顯著高于6、10 h（P＜0.05）、而3 h的IFN-γ含量顯著低于10 h（P＜0.05）。Ⅳ組小鼠3 h的IL-10含量、IL-10/IFN-γ比值顯著低于Ⅱ組（P＜0.05），3 h的IFN-γ含量、10 h的IL-6含量顯著高于Ⅱ組（P＜0.05）。Ⅳ組小鼠10 h的TNF-α含量顯著低于3 h（P＜0.05），6、10 h的IL-10/IFN-γ比值顯著高于3 h（P＜0.05）；而6、10 h的IL-10、IFN-γ含量，10 h的IL-6含量顯著高于3 h（P＜0.05）。

3　討論

3.1小鼠通過自身調(diào)節(jié)提高血液中的GRA及MID，釋放大量的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子抵抗E.coli的早期感染。白細(xì)胞的主要功能是抵御和消滅入侵的病原微生物，實現(xiàn)對機體的保護作用［9］。機體發(fā)生急性感染時，白細(xì)胞總數(shù)往往升高［10-11］。注射E.coli早期（3 h～10 h），小鼠的GRA、MID、LYM及LYM%、MID%較健康對照組顯著下降，GRA%顯著增加。這與小鼠大量白細(xì)胞經(jīng)血管壁向入侵部位游走，發(fā)揮其抗感染（如吞噬、殺滅病原菌）作用有關(guān)。此外，注射E.coli小鼠的WBC、GRA呈先下降后上升，MID、MID%、GRA%呈逐漸上升，而LYM、LYM%呈逐漸下降的變化趨勢。這與小鼠機體發(fā)揮其調(diào)節(jié)機能，提高血液GRA及MID（單核細(xì)胞為主）的數(shù)量，發(fā)揮抗感染作用有關(guān)。

當(dāng)機體功能發(fā)生異常，Th2/Th1細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡狀態(tài)被打破，進而引起疾病的發(fā)生和發(fā)展［12-13］。常選用IL-10/IFN-γ［14］或IL-4/IFN-γ［3］代表Th2/Th1細(xì)胞亞群比例，反映其漂移變化。注射E.coli小鼠各時間點的細(xì)胞因子（TNF-α、IL-10、IFN-γ）及IL-10/IFN-γ比值（除3 h的IL-6外）均較對照組顯著升高，表明注射E.coli可使小鼠釋放大量的細(xì)胞因子激活機體的免疫功能，打破Th2/Th1細(xì)胞亞群平衡，向Th2漂移。

3.2復(fù)方中藥及黃芪多糖通過提高小鼠的WBC，調(diào)節(jié)Th2/Th1細(xì)胞因子的免疫平衡來抵抗E.coli的早期感染。白芍、白術(shù)、魚腥草等組成的中藥復(fù)方則還具有改善骨髓抑制小鼠血象的作用［6］。注射E.coli早期（3 h～10 h），復(fù)方中藥小鼠的WBC、MID及MID%、LYM及LYM%，以及黃芪多糖小鼠的WBC、GRA、MID及LYM等均高于單獨注射E. coli小鼠?？梢姀?fù)方中藥以增加小鼠外周血的LYM、MID為主，提高WBC發(fā)揮抗感染作用；而黃芪多糖提高WBC，則以增加GRA、MID為主。

犀角地黃湯具有降低感染脂多糖小鼠IFN-γ的分泌量，促進Th2/Th1細(xì)胞平衡的恢復(fù)，減輕炎性損傷的作用［15］。本復(fù)方中藥通過抑制E.coli所致小鼠TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-10/IFN-γ比值的升高，提高IL-6，促進Th2向Th1漂移，恢復(fù)Th2/ Th1平衡；而黃芪多糖則以抑制E.coli所致小鼠的IL-10及IL-10/IFN-γ比值升高，促進IFN-γ、IL-6分泌，使Th2向Th1細(xì)胞漂移，恢復(fù)Th2/Th1平衡。

4　結(jié)論

復(fù)方中藥主要通過提高小鼠外周血的WBC（尤其是LYM、MID），促進IL-6分泌，抑制TNF-α、IL-10分泌，使Th2向Th1細(xì)胞漂移，恢復(fù)Th2/ Th1細(xì)胞因子平衡而發(fā)揮機體抵抗感染的作用；而黃芪多糖則以提高小鼠外周血的WBC（尤其是GRA、MID），促進IFN-γ、IL-6分泌，特別是抑制IL-10分泌，使Th2向Th1細(xì)胞漂移，恢復(fù)Th2/Th1細(xì)胞因子平衡而發(fā)揮作用。

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中圖分類號：S859.3

文獻標(biāo)志碼：B

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0066- 03

收稿日期：2014-12-31

基金項目：四川省科技廳支撐項目（2013NZ0032）

作者簡介：王嬋（1989-），女，碩士，從事中西獸醫(yī)與臨床研究，E-mail：wangchan89@163.com

通訊作者：左之才，E-mail：ZZCJL@126.com