江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析

許金俊，禚振男，郭　平，曲昌寶，劉丹丹，陶建平（1.江蘇動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

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江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析

許金俊1，2，禚振男1，2，郭平1，2，曲昌寶1，2，劉丹丹1，2，陶建平1，2
（1.江蘇動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

摘要：從分子水平了解江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲的分類地位與進(jìn)化特征，以江蘇地區(qū)感染火雞組織滴蟲發(fā)病雞群的病變肝臟組織為材料，通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、DNA片段的克隆與測序，獲得該地區(qū)火雞組織滴蟲β-微管蛋白（Betatubulin）序列，通過軟件與GenBank收錄的其他地區(qū)火雞組織滴蟲和相關(guān)蟲體β-微管蛋白基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果獲得的11個(gè)火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因序列相互之間同源性在95.3%～100.0%之間，親緣關(guān)系較近，與德國株相似性94.9%以上，與美國株相似性91.6%以上。同時(shí)，該地區(qū)蟲體在基因進(jìn)化過程中形成2個(gè)大的分枝和多個(gè)小的分枝。表明江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲存在不同的基因型，應(yīng)進(jìn)一步研究其分子流行病學(xué)與種群遺傳學(xué)特征。

關(guān)鍵詞：火雞組織滴蟲；β-微管蛋白；同源性；進(jìn)化關(guān)系

禚振男（1989-），女，碩士生，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學(xué)研究，E-mail：zzn0810@163.com

注：禚振男與許金俊對本文具有同等貢獻(xiàn)

組織滴蟲病又稱“黑頭病”，是由火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）引起雞形目禽類盲腸和肝臟寄生性機(jī)能紊亂的原蟲病，以盲腸腫大、肝臟壞死和排硫磺樣糞便為主要特征。近年來，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，該病在很多地區(qū)有不同程度發(fā)生，死亡率達(dá)到20%～30%，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害。在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，出于對食品安全方面的考慮，大部分治療該病的有效藥物被禁止使用，使得該病又重新暴發(fā)和流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展火雞組織滴蟲病的研究，對于保障養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展具有重要的意義。

微管是組成細(xì)胞骨架的重要組分，它存在于所有真核細(xì)胞中，是由微管蛋白裝配成的長管狀細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)微管呈網(wǎng)狀或束狀分布，參與許多細(xì)胞的功能，如維持細(xì)胞形態(tài)、鞭毛和纖毛的運(yùn)動(dòng)、染色體運(yùn)動(dòng)等［1］。微管又是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸通道，通過干擾微管形成可影響與凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞的凋亡［2-3］。因此，針對微管參與細(xì)胞的分裂增殖和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)特性，可以設(shè)計(jì)阻斷微管功能的抗微管藥物，用于抗腫瘤、抗痛風(fēng)、抗寄生蟲等領(lǐng)域［4］。編碼該蛋白的基因相對較為保守，其進(jìn)化與核子進(jìn)化是平行的，在寄生蟲系統(tǒng)發(fā)育分析方面的研究報(bào)道則相對較少［5］。

本試驗(yàn)擬對該地區(qū)雞群的火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序分析，并與其他地區(qū)火雞組織滴蟲和相關(guān)蟲體β-微管蛋白基因序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，以了解它們之間的遺傳和進(jìn)化關(guān)系，為組織滴蟲病診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查、種群遺傳學(xué)研究和藥物靶位研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1臨床樣品用于PCR擴(kuò)增的11例具有組織滴蟲病典型病變的雞肝組織樣品，來源于江蘇各地（蘇南地區(qū)1例，蘇中地區(qū)6例，蘇北地區(qū)4例）送至揚(yáng)州大學(xué)附屬動(dòng)物醫(yī)院就診的病例，分別標(biāo)號(hào)為HM1～HM11，肝臟采集后于-20℃冰箱凍存。

1.2試劑克隆用載體pGEM-T-Easy，購自Promega公司；宿主菌大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；DL-2 000 Marker、DNA膠回收試劑盒、LA Taq DNA聚合酶，購自TaKaRa公司；1kb DNA Ladder、25 mmol/L MgCl2、dNTP Mix、DNA聚合酶，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3樣品DNA按照酚-氯仿-異戊醇方法提取肝組織DNA，測定濃度后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴(kuò)增按參考文獻(xiàn)［6］設(shè)計(jì)1對引物擴(kuò)增Beta-tublin基因：P1，5′-TTC GTA AAG AAG CTG AAT CC -3′；P2，5′-ACG AGG GAA TGG TAC AAG G-3′。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為400 bp。25 μL PCR擴(kuò)增體系為：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP（10 μmol/L），0.25 μL LA Taq酶，P1、P2引物各2 μL（10 μmol/L），5 μL DNA模板（50 ng/μL），ddH2O 11.25 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸45 s，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.5β-微管蛋白基因的克隆及測序在紫外燈下小心切取目的條帶，用TaKaRa公司的瓊脂糖核酸回收試劑盒純化目的條帶。將純化產(chǎn)物與pGEM-T-Easy載體常規(guī)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)單克隆，在LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖床過夜，堿裂解法抽提質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I酶切鑒定陽性克隆。將鑒定為陽性的質(zhì)粒送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.6β-微管蛋白基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用DNAStar軟件，對所獲得序列進(jìn)行同源性分析，并與從GenBank中讀取的其他蟲體的β-微管蛋白基因序列（表1）進(jìn)行比對。采用MEGA程序中的最大簡約法（MP）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用自展檢驗(yàn)（bootsteap test）估算系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

2　結(jié)果

2.1β-微管蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果將擴(kuò)增后得到的11個(gè)樣品PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，得到約為400 bp左右的目的條帶，目的片段與預(yù)期大小相符。圖為HM1、HM2、HM3、HM4樣品的PCR電泳圖，其余樣品的擴(kuò)增結(jié)果相同。

2.2PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定用純化回收試劑盒分別回收11個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并克隆到pGEMT-Easy載體中，每個(gè)樣品挑取白色菌落堿裂解法提取質(zhì)粒，EcoR I酶切鑒定。圖2為HM1樣品：M12345電泳結(jié)果，出現(xiàn)3.0 kb的載體片段和M123左右的目的片段（圖2），與預(yù)計(jì)相符。

圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果M：1kb DNA Ladder；1～3：陽性肝臟樣品HM1的1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)重組質(zhì)粒

2.3β-微管蛋白基因序列同源性分析經(jīng)過測序獲得的11個(gè)β-微管蛋白基因序列均提交到GenBank，登錄號(hào)分別為KM006029～KM006039。11個(gè)基因序列之間及與相似原蟲的同源性分析結(jié)果見圖3。由圖3可知：江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因序列同源性在95.3%～100.0%之間，與德國株相似性94.9%以上、美國株相似性91.6%以上，與胎兒三毛滴蟲相似性在85.6%～83.6%之間，高于雞四毛滴蟲的82.8%～79.6%，巨型艾美耳球蟲的68.0%～51.7%和柔嫩艾美耳球蟲的67.1%～50.8%。

2.4系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，江蘇地區(qū)火雞組織滴蟲向2個(gè)方向進(jìn)化，其與美國株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。在進(jìn)化的過程中，HM8與德國株的親緣關(guān)系較近，進(jìn)化方向基本一致，且較于火雞組織滴蟲其他株的進(jìn)化是更早的；另一個(gè)進(jìn)化方向中又進(jìn)一步分化成兩個(gè)方向，即HM1、HM2、HM6、HM7、HM11的進(jìn)化是一個(gè)方向的，HM3、HM4、HM5、HM9、HM10的進(jìn)化是一個(gè)方向的，可能存在不同的基因型差異。進(jìn)化樹即顯示了該地區(qū)火雞組織滴蟲的同屬關(guān)系，又表明了該地區(qū)不同蟲株的個(gè)體差異。同時(shí)，該地區(qū)火雞組織滴蟲與毛滴蟲的關(guān)系密切，其進(jìn)化方向是一致的，而八肋游仆蟲的進(jìn)化更早于其他原蟲。

圖3　江蘇地區(qū)與其他地區(qū)火雞組織滴蟲及類似原蟲的β-微管蛋白基因同源性分析

圖4　以β-微管蛋白基因基因序列為分子標(biāo)記的火雞組織滴蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹

3　討論

2006年Van der Heijden等利用ITS-1序列的C-profiling技術(shù)將火雞組織滴蟲基因型分為I、II型和III型［7］，Hauck等2010年同樣利用5.8 S和flanking ITS區(qū)域的C-profiling技術(shù)將火雞組織滴蟲分為A、B、C、D四個(gè)基因型［8］。本研究采用β-微管蛋白基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，江蘇地區(qū)雞源火雞組織滴蟲存在多個(gè)不同的分枝，可能存在不同的基因型。中國地域遼闊，家禽飼養(yǎng)量巨大，組織滴蟲病流行又非常嚴(yán)重［9］，因此，有必要分離更多的地理株或采集更多的病料，利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定、分類和評定，確定火雞組織滴蟲的基因型和變異情況，為該病的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)。下一步我們將進(jìn)一步擴(kuò)增相關(guān)基因，借鑒C-profiling技術(shù)在中國火雞組織滴蟲分型方面進(jìn)行更深入的研究。

本研究對江蘇地區(qū)的11個(gè)β-微管蛋白基因序列分析表明：一方面，江蘇不同地區(qū)之間以及國外不同株之間的火雞組織滴蟲β-微管蛋白基因序列同源性較高，均在91%以上；另一方面，不同地區(qū)間的火雞組織滴蟲基因序列存在一定的差異，這與許金俊等針對18S rRNA基因進(jìn)行進(jìn)化分析的結(jié)果類似［10］。本研究結(jié)果同時(shí)表明，同18S rRNA基因一樣，微管蛋白基因也是一個(gè)研究生物系統(tǒng)發(fā)育、分子進(jìn)化和種群遺傳學(xué)研究的有效候選靶基因，可以進(jìn)一步深入研究β-微管蛋白基因及其功能，微管蛋白與藥物之間的作用機(jī)制，為開發(fā)用于控制組織滴蟲病的高效安全的新藥奠定基礎(chǔ)。

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中圖分類號(hào)：S852.72

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0050- 03

收稿日期：2014-12-02

基金項(xiàng)目：江蘇省普通高校專業(yè)學(xué)位研究生科研實(shí)踐計(jì)劃（2014 SJZZ_0185）；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）面上項(xiàng)目（BK20131229）；揚(yáng)州大學(xué)“新世紀(jì)人才工程”項(xiàng)目（2012）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)二期工程資助項(xiàng)目（2014）；揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金（2014CXJ053）

作者簡介：許金?。?972-），男，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)寄生蟲學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail：jjxu@yzu.edu.cn