麥角甾醇過氧化物抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制試驗

高　麗，王君篪，斯建勇，曹　麗（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京海淀100193）

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麥角甾醇過氧化物抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復制試驗

高麗，王君篪，斯建勇，曹麗
（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京海淀100193）

摘要：為了研究麥角甾醇過氧化物（ergosterol peroxide，PE）抑制PRRSV的活性，在體外用豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-1a毒株感染Marc-145細胞，在病毒感染的同時加入不同濃度的PE，24 h后固定細胞用間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)的病毒N蛋白，同時收集細胞培養(yǎng)上清檢測病毒滴度，結(jié)果顯示，PE可劑量依賴性地抑制PRRSV在細胞中復制。分別用PE預處理病毒或細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒與PE共孵育并不會抑制病毒感染細胞活性，而PE預處理細胞則會抑制病毒在細胞中復制。表明PE通過作用于宿主細胞而抑制PRRSV在體外細胞中復制，為進一步開發(fā)利用PE提供了基礎。

關鍵詞：過氧麥角甾醇；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；抗病毒

1987年首次報道豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）以來，人們做了大量研究工作以控制和消除PRRS。但目前使用的商品化的疫苗并不能有效地預防和控制PRRSV。已有報道證實一些天然化合物或者組分具有抑制PRRSV的功能，比如磺酸鈉和板藍根多糖等能在體外Marc-145細胞上有效地抑制PRRSV復制［1］。

麥角甾醇過氧化物（ergosterol peroxide，PE）廣泛存在于珊瑚［2］以及蘑菇，如靈芝［3］，平菇［4］，紅汁乳菇［5］和樺褐孔菌［6］中。PE具有多種生物活性，包括體外抗腫瘤［5］、促凋亡［7］、抗炎［6］等活性。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，隱孔菌提取物在體內(nèi)和體外具有抗PRRSV活性。從隱孔菌中分離提取到了大量PE，然而PE是否具有抗PRRSV的活性，目前罕見文獻報道，因此在本文中我們對PE抑制PRRSV的活性和機制進行了研究。

1　材料與方法

1.1Marc-145細胞系與PRRS病毒毒株CH-1a （GenBank序列號：AY032626）由中國農(nóng)業(yè)大學封文海教授饋贈，細胞培養(yǎng)基DMEM，青霉素/鏈霉素雙抗，0.25%胰酶-EDTA，胎牛血清，購自邁晨科技（北京）有限公司；鼠抗PRRSV N蛋白單抗（SDOW-17），購自Rural Technologies公司；MTT試劑，購自Sigma公司；Real-Time相關試劑，購自北京康維世紀生物科技有限公司。

1.2間接免疫熒光吸棄細胞培養(yǎng)液，PBS洗1次，然后用固定液（冷甲醇丙酮1∶1）4℃固定細胞10 min；吸棄固定液，用PBS洗兩次，5%山羊血清37℃封閉30 min；吸棄上清，加抗PRRS病毒N蛋白的一抗SDOW17（1∶10 000）稀釋，37℃孵育1 h吸棄上清，PBS洗3次；加FITC標記的兔抗鼠二抗，37℃避光1 h；吸棄上清，PBS洗3次；熒光顯微鏡下觀察病毒陽性孔。

1.3MTT將細胞接種到96孔板，37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h；用培養(yǎng)液稀釋化合物，以等體積的DMSO做溶劑對照；吸棄細胞培養(yǎng)液，加入含有PE或DMSO的培養(yǎng)液，37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，37℃孵育10 min，使結(jié)晶物充分融解。用酶標儀在550 nm波長處測吸光度，以對照組細胞存活率為100%，計算試驗組細胞存活率。

1.4病毒感染抑制試驗將Marc-145細胞接種到96孔板，于37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。接種PRRSV毒株CH-1a（MOI=0.01），病毒感染的同時加入不同濃度的PE或10 units/mL的IFN-α，37℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，收集上清測定病毒TCID50。同時固定細胞，做間接免疫熒光試驗。

2　結(jié)果

2.1PE抑制PRRS病毒在細胞中復制如圖1所示，與DMSO對照相比，當PE的濃度在40 μg/mL時，病毒滴度下降了大約10倍，而在PE濃度為80 μg/mL時，病毒滴度下降了大約100倍。PE在Marc-145細胞抑制CH-1a毒株復制的50%有效濃度（EC50）是27.14 μg/mL。

圖1　PE抑制PRRSV CH- 1a毒株在Marc- 145細胞中復制A：間接免疫熒光檢測細胞內(nèi)病毒；B：PE降低細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度（TCID50）

2.2MTT試驗確定PE對Marc-145細胞的毒性為了排除PE細胞毒性對病毒復制干擾的影響，用MTT試驗檢測了Marc-145細胞在不同濃度PE存在下的存活率，如圖2所示，PE對Marc-145細胞的CC50是277 μg/mL，遠遠超過了EC50值，PE對于CH-1a感染Marc-145細胞的治療指數(shù)（CC50/EC50）為10.3。

2.3初步確定PE的作用靶點為了研究PE是否直接殺傷病毒，將病毒與PE共孵育，然后測定病毒TCID50，結(jié)果（圖3A）發(fā)現(xiàn)，與對照相比，PE并不能明顯降低病毒滴度。而將PE預處理細胞2 h，再用病毒感染細胞（MOI=0.01），DMSO對照組病毒滴度平均值為105.3TCID50/mL，而PE預處理組，病毒滴度則下降到104.1TCID50/mL，與對照組相比，下降了16倍（圖3B）。

圖2　MTT法確定PE對Marc－145細胞的毒性

圖3　PE作用靶點初步分析A：PE對PRRS病毒顆粒的直接殺傷作用；B：PE預處理細胞抑制PRRSV在細胞中復制

3　討論

隱孔菌是一種野生大型真菌，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中多用于治療氣管炎和哮喘［8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，隱孔菌子實體的水提取物對于PRRSV體內(nèi)和體外感染具有強烈的抑制功能［9］。但是水提取物是一種粗提物，而粗提物的活性容易受藥材質(zhì)量及提取過程的影響，因此我們進一步研究了隱孔菌提取物抑制PRRSV復制的有效成分，發(fā)現(xiàn)來自于隱孔菌的麥角甾醇過氧化物（PE）在體外Marc-145細胞上能顯著地抑制PRRSV Ch-1a復制，初步機制研究表明，PE主要通過作用于細胞而抑制病毒感染。

馬增強等人結(jié)合現(xiàn)代色譜純化技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分離到一個來自隱孔菌的新化合物CM-H-L-5，其具有抑制PRRSV體外復制的活性［10］，但他們的結(jié)果也顯示，CM-H-L-5并不是隱孔菌提取物中的惟一活性成分。與馬增強等人報道的來自化合物CM-H-L-5相比，PE具有更強烈的體外抑制病毒復制活性（EC50為27.14 μg/mL）。病毒抑制劑的作用機制通常有兩種，一種是靶向病毒，另一種是靶向細胞。盡管我們初步研究表明，PE主要通過作用于細胞而抑制病毒復制，但是PE究竟怎樣抑制宿主細胞的功能還需進一步研究。

參考文獻：

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［3］Wu Q P，Xie Y Z，Deng Z，et al.Ergosterol peroxide isolated from Ganoderma lucidum abolishes microRNA miR-378-mediated tumor cells on chemoresistance［J］.PLoS One，2012，7（8）：e44579.

［4］Ramos-Ligonio A，Lopez-Monteon A，Trigos A，Trypanocidal activity of ergosterol peroxide from Pleurotus ostreatus［J］.Phytother Res，2012，26（6）：938-943.

［5］Gao J M，Wang M，Liu L P，et al.Ergosterol peroxides as phospholipase A（2）inhibitors from the fungus Lactarius hatsudake［J］. Phytomedicine，2007，14（12）：821-824.

［6］Ma L，Chen H，Dong P，et al.Anti-inflammatory and anticancer activities of extracts and compounds from the mushroom Inonotus obliquus［J］.Food Chem，2013，139（1-4）：503-508.

［7］Kobori M，Yoshida M，Ohnishi- Kameyama M，et al.Ergosterol peroxide from an edible mushroom suppresses inflammatory responses in RAW264.7 macrophages and growth of HT29 colon adenocarcinoma cells［J］.Br J Pharmacol，2007，150（2）：209-219.

［8］Zhao L X，Xu L H，Jiang C L，Methods for the study of endophytic microorganisms from traditional Chinese medicine plants［J］.Methods Enzymol，2012，517：3-21.

［9］Gao L，Zhang W，Sun Y，et al.Cryptoporus volvatus extract inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in vitro and in vivo［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63767.

［10］Ma Z，Zhang W，Wang L，et al.A novel compound from the mushroom Cryptoporus volvatus inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in vitro［J］.PLoS One，2013，8（11）：e79333.

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0047- 02

收稿日期：2016-01-25

基金項目：中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所創(chuàng)新團隊項目

作者簡介：高麗（1986-），女，助理研究員，博士，從事抗病毒天然產(chǎn)物的篩選與機制研究，E-mail：lgao@implad.ac.cn

通訊作者：曹麗，E-mail：lcao@implad.ac.cn