豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白C和D抗原位點(diǎn)在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)

于天飛，陳　剛，張　雙，史俊龍，朱可佳，張喜文（.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾6006；.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030）

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豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白C和D抗原位點(diǎn)在大腸桿菌中的串聯(lián)表達(dá)

于天飛1，陳剛1，張雙2，史俊龍1，朱可佳1，張喜文1
（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：使用大腸桿菌偏好性密碼子人工合成了豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）S蛋白C和D抗原位點(diǎn)多肽基因序列。依次將C和D抗原位點(diǎn)多肽基因序列克隆至表達(dá)載體pET-32a中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western Blot分析。結(jié)果顯示，在分子量25 kDa處有1條明顯的蛋白表達(dá)條帶，且能被TGEV陽(yáng)性血清識(shí)別。本研究為T(mén)GEV的血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒；纖突蛋白；抗原位點(diǎn)；串聯(lián)表達(dá)

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）引起的以仔豬腹瀉為主要特征的傳染病，2周齡以內(nèi)發(fā)病仔豬的死亡率可達(dá)100%。研究表明，TGEV纖突（S）蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是惟一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白［1］。S蛋白含有4個(gè)抗原位點(diǎn)，從氨基末端開(kāi)始依次定為C、B、D和A。其中位點(diǎn)C和位點(diǎn)D是不依賴(lài)于糖基化修飾的線性抗原表位［2］。因此，這兩個(gè)位點(diǎn)適合在原核系統(tǒng)中進(jìn)行體外表達(dá)。本研究擬在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中串聯(lián)表達(dá)TGEV S蛋白C和D抗原位點(diǎn)，利用Western Blot方法檢測(cè)重組蛋白的抗原性。本研究將為建立TGEV感染的血清學(xué)診斷方法和檢測(cè)技術(shù)奠定一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α和Rosetta（DE3），表達(dá)載體pET-32a由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室（以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室）保存。

1.2酶和抗體T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ，購(gòu)自TaKaRa公司；TGEV陽(yáng)性血清和健康豬血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。羊抗豬辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3核苷酸鏈的合成及退火參照GenBank收錄的TGEV TH-98株S基因（GenBank登錄號(hào)：AF494337）中的C和D抗原位點(diǎn)的核苷酸序列，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子表，對(duì)2種類(lèi)型的B細(xì)胞線性表位［2］C1（LPPNSDVVL）和C2（LIPNSDVVL）以及D抗原表位（CYTVSDSSFFSYGEIPFGVTDGPR）編碼核酸序列進(jìn)行了優(yōu)化。設(shè)計(jì)合成了4條互補(bǔ)的寡聚核酸片段，5′端磷酸化。設(shè)計(jì)合成的C基因序列為含有C1和C2的雙拷貝基因。其中C（F）或D（F）5′端引入BglⅡ（AGATCT）酶切位點(diǎn)和柔性氨基酸序列（GGGGS）的編碼核酸堿基，3′端引入BamHⅠ（GGATCC）和XhoⅠ（CTCGAG）酶切位點(diǎn)；C（R）或D（R）5′端引入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，3′端引入BglⅡ酶切位點(diǎn)。4條寡聚核酸片段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。C（F）：GATCTGGTGGTGGTGGTTCCTGCTATACCGTGAGC GATAGCAGCTTTTTTAGCTATGGCGAAATTCCGTTTGGCGTGACCGATGGCCCGCGTGGATCCAC；C（R）：TCGAGTGGATCCACGCGGGCCATCGGTCACGCCAAACGGAATTTCGCCATAGCTAAAAAAGCTGCTATCGCTCACGGTATAGCAGGAACCACCACCACCA；D-（F）：GATCTGGTGGTGGTGGTTCCTGCTATACCGTGAGCGATAGCAGCTTTTTTAGCTATGGCGAAATTC CGTTTGGCGTGACCGATGGCCCGCGTGGATCCAC；D（R）：TCGAGTGGATCCACGCGGGCCATCGGTCACGCCAAACGGAATTTCGCCATAGCTAAAAAAGCTGCTATCGCTCACGGTATAGCAGGAACCACCACCACCA。

合成的短鏈核苷酸片段分別稀釋成25 pmol/mL的溶液，各取25 μL，C（F）和C（R）1∶1混合；D（F）和D（R）1：1混合。用PCR儀設(shè)定程序?yàn)?6℃至4℃緩慢降溫。退火后溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pET-32a經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收?；厥掌闻cC抗原位點(diǎn)基因退火片段在T4 DNA連接酶的作用下16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。將酶切鑒定正確的菌液送由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-C1C2。將質(zhì)粒pET-32a-C1C2繼續(xù)用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收。回收片段與D抗原位點(diǎn)基因退火片段連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。酶切鑒定正確的菌液測(cè)序。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-C1C2D。

1.5重組蛋白的表達(dá)重組質(zhì)粒pET-32a-C1C2D轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Rosetta（DE3）。重組菌37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期（OD600值=0.6～0.8時(shí)），加IPTG至終濃度1.0 mmol/L，誘導(dǎo)4 h。取誘導(dǎo)后菌液1 mL，12 000 r/min離心5 min，棄上清。按照每1 mg菌體濕重加30 μL PBS的比例重懸菌體沉淀。SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳檢測(cè)表達(dá)情況。利用BandScan 5.0軟件對(duì)重組蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.6表達(dá)蛋白的純化及抗原性鑒定表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，凝膠放入4℃預(yù)冷的0.3 mol/L KCl 5 min，切下含目的蛋白的凝膠，搗碎，加入PBS懸起，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min，留取上清。采用Bradford檢測(cè)法對(duì)重組蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定［3］。純化的表達(dá)蛋白經(jīng)SDSPAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，PBST洗3遍，浸入1∶100 PBS稀釋的TGEV陽(yáng)性血清或健康豬血清中，37℃2 h，PBST洗3遍后浸入1∶1 000 PBS稀釋的羊抗豬辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，室溫作用1 h，PBST洗滌3次后用4-氯-1-萘酚（4-CN）顯色。

2　結(jié)果與分析

2.1重組蛋白的表達(dá)含有重組質(zhì)粒pET-32a-C1C2D的大腸桿菌Rosetta（DE3），IPTG 37℃誘導(dǎo)4 h后全菌體細(xì)胞沉淀SDS-PAGE分析見(jiàn)圖1。在誘導(dǎo)后，重組菌表達(dá)出約為25 kDa的蛋白，25 kDa 與pET-32a載體攜帶的Trx標(biāo)簽蛋白加上目的蛋白的理論分子量大小相符。利用BandScan圖象分析軟件分析表明，IPTG誘導(dǎo)4 h后全菌體細(xì)胞沉淀中表達(dá)蛋白的相對(duì)含量最高為26.5%。

圖1　原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS- PAGE分析

2.2重組蛋白的抗原性鑒定SDS-PAGE預(yù)制膠每孔加入純化的Trx標(biāo)簽蛋白或表達(dá)蛋白20 μg，Western Blot結(jié)果表明，Trx標(biāo)簽蛋白不能與TGEV陽(yáng)性血清反應(yīng)而表達(dá)蛋白能被TGEV陽(yáng)性血清所識(shí)別（圖2），且表達(dá)蛋白不與健康豬血清反應(yīng)（結(jié)果未列出）。

圖2　Western Blot鑒定重組蛋白的抗原性1：Marker標(biāo)記；2：重組蛋白與TGEV陽(yáng)性血清的反應(yīng)；3：Trx標(biāo)簽蛋白與TGEV陽(yáng)性血清的反應(yīng)

3　討論

S蛋白包含的A和B抗原位點(diǎn)為依賴(lài)于糖基化作用的構(gòu)象表位，因此限制了對(duì)它們進(jìn)行原核表達(dá)的研究［4］。而C和D是抗原位點(diǎn)不依賴(lài)于糖基化修飾的線性抗原表位［5］，適合在原核系統(tǒng)中進(jìn)行體外表達(dá)。根據(jù)于天飛等［2］利用DNAStar軟件抗原性模擬結(jié)果，C抗原位點(diǎn)可以分為2種類(lèi)型，分別命名為C1和C2。本研究中利用合成的方法將2種類(lèi)型的C抗原位點(diǎn)串聯(lián)，形成雙拷貝基因，以期重組抗原可針對(duì)不同的TGEV抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)性。Western Blot試驗(yàn)表明，在大腸桿菌Rosetta（DE3）中串聯(lián)表達(dá)的C、D抗原位點(diǎn)蛋白具有良好的抗原性。本研究所獲得的重組蛋白為T(mén)GEV的血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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Tandem Expression of C and D Antigenic Sites of TGEV S Protein in E.coli

YU Tian-fei1，CHEN Gang1，ZHANG Shuang2，SHI Jun-long1，ZHU Ke-jia1，ZHANG Xi-wen （1.College of Life Science and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2.College of life science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：The genes which code transmissible gastroenteritis virus（TGEV）S protein C and D antigen sites were respectively using E.coli optimal codons，respectively.The recombinant expression vector was constructed by cloning genes of C and D antigen sites into the prokaryotic expression plasmid pET-32a in turn.The E.coli Rosetta（DE3）was transformed with recombinant plasmid，and the recombinant protein was expressed after induction with IPTG .SDS-PAGE and Western blot with the product of bacterial culture induction with IPTG showed that the molecular mass of the protein was approximately 25 kDa，which was identified by positive sera of TGEV.This study provided essential material foundation for establishment of TGEV serology diagnostic method.

Key words：TGEV；spike protein；antigen site；expression

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0031- 03

收稿日期：2014-07-22

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（QC2014C034）；齊齊哈爾大學(xué)青年教師科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2010k-M08）

作者簡(jiǎn)介：于天飛（1980-），男，副教授，博士，主要從事動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究，E-mail：yutianfei2001@163.com