豬Sirt5基因的克隆及其腺病毒載體的構建和鑒定

黃魁英，馮永達，明飛平，肖安吉，盧志鵬，楚品品，黃瀚威，譚家裕，夏楓耿，黃朝遠，楊　軍，蔡海明，馬苗鵬，張玲華（.廣州市微生物研究所，廣東廣州50663；.華南農業(yè)大學生命科學學院廣東省農業(yè)生物蛋白質功能與調控重點實驗室，廣東廣州5064）

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豬Sirt5基因的克隆及其腺病毒載體的構建和鑒定

黃魁英1，馮永達2，明飛平1，肖安吉2，盧志鵬2，楚品品2，黃瀚威2，譚家裕2，夏楓耿1，黃朝遠2，楊軍2，蔡海明2，馬苗鵬2，張玲華2
（1.廣州市微生物研究所，廣東廣州510663；2.華南農業(yè)大學生命科學學院廣東省農業(yè)生物蛋白質功能與調控重點實驗室，廣東廣州510642）

摘要：為了從豬腦中克隆得到Sirt5基因，并構建腺病毒載體，提取長白豬腦組織總RNA，利用RT-PCR和PCR擴增得到Sirt5基因。再將此基因克隆至穿梭載體上，構建重組腺病毒的穿梭質粒pShuttle-IRES-Sirt5。經酶切線性化，電擊轉化已含骨架載體pAdEasy-1DNA的BJ5183+感受態(tài)菌，得到重組腺病毒質粒Ad-Sirt5。重組腺病毒質粒經酶切線性化鑒定。結果本試驗獲得的Sirt5基因與NCBI公布序列一致。利用細菌同源重組技術構建重組腺病毒載體，經酶切鑒定正確。表明本試驗成功克隆得到Sirt5基因，并成功構建Sirt5基因的腺病毒載體。

關鍵詞：豬；Sirt5基因；重組；腺病毒

馮永達（1992-），男，本科，從事農業(yè)生物技術工作，E-mail：931671302@qq.com

注：馮永達與黃魁英對本文具有同等貢獻

Sirtuins（Sirt）蛋白家族是一類與壽命調節(jié)、新陳代謝和疾病有關的重要蛋白。目前在哺乳動物中已發(fā)現至少7種Sirt基因（Sirt1～Sirt7）。其中，Sirt5是存在于線粒體中的一種NAD+依賴性去乙酰化酶，在腦、肝、心和肺等廣泛表達［1］。Sirt5在新陳代謝方面具有重要作用，但具體機制并不是很清楚，隨著研究的深入，Sirt5有望成為代謝疾病治療的新靶點。

重組腺病毒具有宿主范圍廣，病毒粒子穩(wěn)定性較好，有效感染細胞實現外源基因表達，可容納較長外源DNA，且不整合到染色體中等優(yōu)點，已被廣泛應用于臨床和生物治療［2］。豬與人類在解剖學、遺傳學和生理機能上極為相似，可作為研究各種人類醫(yī)學方面的生物模型。目前，豬已被廣泛用于免疫機理研究、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等器官移植研究［3］。與此同時，在研究Sirt5分子控制細胞生理功能上，豬也是一種理想的模型。因此本實驗試圖獲取豬Sirt5基因，并構建過表達腺病毒載體，為進一步研究基因在細胞增殖分化中的作用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料載體pShuttle-IRES-hrGFP-2和含pAdEasy-1 DNA的BJ5183+感受態(tài)，購自美國Stratagene公司；DH5α感受態(tài)菌株及HEK293細胞株為本實驗室保存。

1.2Sirt5基因克隆取備好的組織于液氮中研磨，TRIZol法提取總RNA，經RT-PCR反應合成cDNA。根據豬Sirt5基因序列（GenBank：NM_ 001105

308），設計引物，上游（Sirt5-F-1）：AACCTGATGCCACCTCTCTGG；下游（Sirt5-R-1）：CGGGACGACTAAGAGACAGGTT，進行PCR擴增，產物長度為947 bp。將擴增產物連入T-vector，構建T-Sirt5質粒，轉化DH5α感受態(tài)細菌，進行PCR鑒定。

1.3Sirt5穿梭載體及重組腺病毒載體的構建及鑒定用帶有EcoR V和Xho I酶切位點的引物：上游（Sirt5-F-2）：GATATCCCACCATGCCACCTCTCTG；下游（Sirt5-R-2）：CCGCTCGAGCTAAGAGACAGGTTCA，以T-Sirt5質粒為模板，進行PCR擴增，產物長度為956 bp。擴增產物與pShuttle-IRES-hrGFP-2連接，獲重組質粒pShuttle-IRESSirt5，用EcoR V和Xho I雙酶切進行鑒定。pShuttle-IRES-Sirt5經EcoR I線性化，轉化含pAdEasy-1 DNA的感受態(tài)菌BJ5183+進行同源重組，獲重組質粒Ad-Sirt5，用Pac I酶進行酶切鑒定。

1.4重組腺病毒的包裝擴增Ad-Sirt5經PacⅠ酶切線性化，在Lipofectamine2000介導下轉染HEK293細胞（細胞融合至70%～80%），轉染后48 h觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.5RT-PCR檢測Sirt5基因的表達收集轉染后的HEK293細胞，抽提RNA，逆轉錄得到cDNA，根據豬Sirt5基因序列，設計RT-PCR引物，上游（Sirt5-F-3）：CAAGCACATAGTTGTCATT；下游（Sirt5-R-1）：TTCTCCAATAACCTCCTG，RT-PCR檢測Sirt5基因的表達，目的產物長度86 bp。

2　結果及分析

2.1Sirt5全長基因的克隆以cDNA為模板，PCR擴增得到大小為947 bp的Sirt5基因，結果如圖1所示。重組質粒T-Sirt5經測序結果正確。

圖1　T- Sirt5的PCR鑒定M：DL-2 000 Marker；1：Sirt5基因PCR產物

2.2Sirt5重組腺病毒載體的構建重組質粒pShuttle-IRES-Sirt5經雙酶切和PCR鑒定，結果正確，如圖2A和B。Ad-Sirt5經PacⅠ酶切鑒定，可見1條3.5 kb的小片段，如圖2C，結果正確。

圖2　pShuttle- IRES- Sirt5陽性克隆鑒定A：雙酶切鑒定；B：PCR鑒定；C：腺病毒載體Pac I酶切鑒定

2.3重組腺病毒的包裝擴增及鑒定重組腺病毒轉染HEK293細胞（60%～70%融合狀態(tài)，如圖3A）后，培養(yǎng)48 h，由圖3B和3C可知，GFP在HEK293細胞中成功表達。

2.4Sirt5基因表達的檢測提取轉染后HEK293細胞總RNA，逆轉錄后RT-PCR檢測Sirt5的表達，結果顯示，含有Sirt5基因的重組腺病毒載體轉染HEK293細胞擴增出了相應大小的基因片段，如圖4，由此判斷Sirt5基因能在HEK293細胞中成功轉錄出cDNA。

圖3　轉染細胞的顯微觀察A：轉染前的HEK293細胞；B：可見光下的轉染細胞；C：熒光激發(fā)下的轉染細胞

圖4　Sirt5重組腺病毒載體轉染HEK293細胞后RT- PCR檢測M：DL-2 000 Marker；1、2、3：Sirt5基因PCR產物

3　討論

Sirtuins（Sirt）蛋白家族在哺乳動物細胞中主要有7個成員：Sirt1～Sirt7。目前有相當數量的文章報告顯示，該家族在細胞和動物的生理機能、疾病治療和壽命調控都具有重要作用［4-5］。Sirt1主要作用于FOXO家族和NF-kB，調節(jié)新陳代謝、炎癥和壽命等；Sirt2作用于PAR3和微管蛋白等，參與細胞周期調節(jié)；Sirt3作用于AceCS2和GDH等，參與新陳代謝調節(jié)；Sirt4作用于GDH，促進胰島素分泌；Sirt6作用于組蛋白H3K9和H5K56等，參與DNA修復；Sirt7作用于RNA聚合酶I，參與DNA轉錄［6］。但是對于Sirt5的研究和報道相對較少，主要報道發(fā)現，Sirt5能夠調節(jié)氨甲?；?磷酸合成酶（CPS1）促進尿素循環(huán)［7-8］，也能通過尿酸氧化酶調節(jié)嘌呤代謝［9］和促進賴氨酸去琥珀酰和丙二?；瘜崿F能量代謝調控［10］。因此，尋找和建立有效的研究手段勢必推動Sirt5更多研究價值的發(fā)現。

由于腺病毒載體具有各方面優(yōu)勢，已被廣泛應用于臨床實驗中［11］，本試驗將腺病毒穿梭質粒轉化至含骨架質粒的重組菌種，構建Sirt5重組腺病毒載體，其轉染HEK293細胞后，確定具有病毒感染效果。綜上所述，本試驗成功構建具有活性的腺病毒載體Ad-Sirt5，為后續(xù)Sirt5功能研究或疾病治療等奠定基礎。

參考文獻：

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Amplification geneof swine Sirt5 and construction of its adenovirus vector

HUANG Kui-ying1，FENG Yong-da2，MING Fei-ping1，XIAO An-ji2，LU Zhi-peng2，CHU Pin-pin2，HUANG Han-wei2，TAN Jia-yu2，XIA Feng-geng1，HUANG Chao-yuan2，YANG Jun2，CAI Hai-ming2，MA Miao-peng2，ZHANG Ling-hua2
（1.Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，China；2.College of Life Sciences of South China Agricultural University，Function and Regulation of Agricultural Biotechnology protein of Guangdong Province Key Laboratory，Guangzhou 510642，China）

Abstract：Porcine Sirt5 gene was cloned and constructed into an adenovirus vector.Total RNA was extracted from Landrace brain，and the Sirt5 gene was amplified by RT-PCR.Then the Sirt5 gene was cloned into pShuttle-IRES-hrGFP-2 shuttle vector to construct a recombinant adenovirus shuttle plasmid named pShuttle-IRES-Sirt5 . The recombinant shuttle plasmid was transformed into BJ5183+ competent bacteria contained pAdEasy-1 DNA backbone carrier by electroporation method to construct adenoviral plasmid Ad-Sirt5.The Sirt5 gene obtained in this study was indentical with the NCBI published sequence.The recombinant shuttle carrier was restructured into adenovirus vector by homologous recombination in bacteria and confirmed to be correct by restriction enzyme analysis.The Sirt5 gene was cloned and recombinant adenovirus expression vector was constructed successfully in this study.

Key words：porcine；Sirt5；reorganization；adenovirus

中圖分類號：Q782

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2016）03- 0003- 03

收稿日期：2015-06-11

基金項目：廣東省自然科學基金（2014A030313449）；廣東省大學生創(chuàng)新訓練項目（1056413052）；廣州市科技惠民項目（2014Y2-00116）；廣州市科學研究項目（201510010057）

作者簡介：黃魁英（1982-），女，高級工程師，碩士，研究方向為獸醫(yī)免疫學，E-mail：qiushuixian2014@163.com

通訊作者：張玲華，E-mail：lhzhang@scau.edu.cn

Corresponding author：ZHANG Ling-hua