流式細(xì)胞磁珠微陣列法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平在穩(wěn)定期和急性加重期哮喘中的意義

杜春玲　徐　侃　閔智慧　蘇孝瓊　董　年　白豐璽　陳智鴻△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科　上海　200032;2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸科　上?！?01700;3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年科,4實(shí)驗(yàn)研究中心　上?！?00032)

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流式細(xì)胞磁珠微陣列法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平在穩(wěn)定期和急性加重期哮喘中的意義

杜春玲1,2徐侃3閔智慧4蘇孝瓊1董年1白豐璽1陳智鴻1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科上海200032;2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸科上海201700;3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年科,4實(shí)驗(yàn)研究中心上海200032)

【摘要】目的探討流式細(xì)胞磁珠微陣列法(cytometric beads array,CBA)檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平在穩(wěn)定期和急性加重期哮喘中的意義。方法納入慢性持續(xù)期哮喘40例,急性發(fā)作期哮喘22例,健康人 18例。抽取外周血2 mL,采用CAB法檢測(cè)外周血清中細(xì)胞因子水平,并分析各細(xì)胞因子特征及與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。全自動(dòng)血細(xì)胞及生化儀檢測(cè)血常規(guī),C反應(yīng)蛋白和降鈣素原。結(jié)果定制含7種細(xì)胞因子微球(分別為IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,TNF-α,IFN-γ)的CBA試劑盒。與健康人相比,7種細(xì)胞因子在慢性持續(xù)期哮喘無(wú)明顯改變。急性發(fā)作期哮喘細(xì)胞因子升高分為5種亞群,分別為IL-6升高型(22.8%)、IL-6/TNF-α雙高型(13.6%)、IL-5升高型(31.8%)、IL-17升高型(占13.6%)及細(xì)胞因子正常型(占18.2%)。其中,IL-6、TNF-α明顯升高,較健康人分別升高了6.28～12倍和17.3倍。IL-6升高型、IL-6/TNF-α升高型與白細(xì)胞及C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)(R2=0.63,R2=0.67;P<0.05)。結(jié)論CBA法可快速檢測(cè)哮喘血清標(biāo)本的多種細(xì)胞因子水平,細(xì)胞因子在慢性持續(xù)期無(wú)明顯升高,但I(xiàn)L-6、TNF-α、WBC和CRP的綜合指標(biāo)有助于判斷由細(xì)菌感染誘發(fā)的急性加重,并快速指導(dǎo)抗生素的使用。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞因子;哮喘;流式細(xì)胞磁珠微陣列法

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81270078,81470211).

哮喘是氣道對(duì)無(wú)害化過(guò)敏原的過(guò)度反應(yīng)。CD4+T 淋巴細(xì)胞分化失衡(Th2>Th1)是大部分哮喘患者氣道炎癥持續(xù)存在的主要原因。但臨床中的哮喘又非常復(fù)雜,如非過(guò)敏性哮喘、晚發(fā)型哮喘、哮喘伴有慢阻肺、肥胖型哮喘等,即哮喘的致病過(guò)程除了傳統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞比例失衡,還可能有多種炎性細(xì)胞如嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等參與。細(xì)胞因子是聯(lián)系各種細(xì)胞間的信號(hào)分子,包括免疫細(xì)胞間，免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞間。因此,細(xì)胞因子水平在哮喘致病機(jī)制、與臨床特征的相關(guān)性、臨床應(yīng)用價(jià)值等方面?zhèn)涫荜P(guān)注。盡管氣道/肺局部的細(xì)胞因子最為準(zhǔn)確,如氣道黏膜活檢、支氣管肺泡灌洗等,但哮喘為良性疾病,患者多不愿接受有創(chuàng)檢查,所以通過(guò)外周血清/血漿,或外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)反應(yīng)細(xì)胞因子水平比較常用,但國(guó)際上對(duì)其利用價(jià)值尚存在爭(zhēng)議[1-2]。

我們采用流式細(xì)胞磁珠微陣列法(cytometric beads array,CBA)檢測(cè)穩(wěn)定期哮喘和急性發(fā)作期哮喘外周血清中細(xì)胞因子水平,試圖分析細(xì)胞因子在各期哮喘中的特征,并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

資 料 和 方 法

研究對(duì)象第一部分研究對(duì)象為2014年6月至9月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院門(mén)診就診的穩(wěn)定期哮喘患者。納入標(biāo)準(zhǔn):需符合2014年全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)的診斷標(biāo)準(zhǔn);年齡18～70歲;輕度持續(xù)和中度持續(xù)支氣管哮喘患者。排除標(biāo)準(zhǔn):慢性阻塞性肺疾病;社區(qū)獲得性肺炎,支氣管擴(kuò)張,肺結(jié)核,嚴(yán)重的慢性心臟、肝、腎病,糖尿病、結(jié)締組織病、妊娠等。共入選輕度持續(xù)性哮喘患者20例,中度持續(xù)性哮喘患者20例,健康人18例。

第二部分研究對(duì)象為2014年10月至2015年1月期間在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院門(mén)急診就診的急性發(fā)作期哮喘患者。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡18～70歲;符合2014年GINA關(guān)于哮喘急性發(fā)作的診斷標(biāo)準(zhǔn),包括氣喘、咳嗽或胸悶癥狀突然發(fā)生;或原有癥狀急劇加重,常有呼吸困難,以呼氣流量降低為特征。排除標(biāo)準(zhǔn):穩(wěn)定期哮喘,哮喘患者由于其他疾病導(dǎo)致的呼吸困難如急性社區(qū)獲得性肺炎、肺栓塞、氣胸,伴有嚴(yán)重的的慢性心臟、肝、腎病,糖尿病、結(jié)締組織病等。共納入急性發(fā)作期哮喘22例,健康人18例。

該臨床研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為A-026-1.1),實(shí)施時(shí)均告知患者研究目的、獲益和潛在風(fēng)險(xiǎn),并簽署知情同意書(shū)。

主要試劑和儀器CBA人可溶性蛋白主緩沖試劑盒 (美國(guó) BD公司):主要包含檢測(cè)稀釋液30 mL,捕獲微球稀釋液5 mL,檢測(cè)稀釋液5 mL,血清的捕獲稀釋液5 mL,清洗緩沖液 130 mL,標(biāo)準(zhǔn)微球A1 0.25 mL,標(biāo)準(zhǔn)微球A9 0.25 mL,標(biāo)準(zhǔn)微球F1 1 mL,標(biāo)準(zhǔn)微球F9 0.25 mL,PE標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)微球F1 0.25 mL,PE標(biāo)記陽(yáng)性對(duì)照 0.5 mL。流式檢測(cè)儀器為Aria Ⅱ(美國(guó)BD Biosciences公司)。CBA分析軟件為FCAPArray Version 3.0。血常規(guī)采用Sysmex 全自動(dòng)血液分析儀(XE 2100),C反應(yīng)蛋白和降鈣素原(procalcitonin,PCT)采用日立全自動(dòng)生化分析儀(日立7600)檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)方法

CBA試劑盒細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備將細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品(2 500 pg/mL)置于15 mL離心管中。標(biāo)記8個(gè)流式管,分別為1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128,1∶256,檢測(cè)稀釋液為陰性對(duì)照。以上每管先加入300μL檢測(cè)稀釋液。從原液管開(kāi)始對(duì)倍稀釋即從原液管中吸300μL到1∶2管中混勻,再?gòu)?∶2管中吸300μL加入 1∶4管,以此類(lèi)推。

混合的捕獲微球制備每種捕獲微球取出10μL,根據(jù)要檢測(cè)總樣本數(shù),每種捕獲微球吸取的體積為:10μL×樣本數(shù)。混合7種捕獲微球,200×g,離心5 min,棄上清,重懸于血清增強(qiáng)液中,避光、室溫靜置30 min。上述每管中加入50μL混合的捕獲微球,室溫孵育1 h,再加入50μL PE標(biāo)記的檢測(cè)抗體,室溫孵育2 h。加入1 mL 清洗緩沖液,200×g,離心5 min。吸去上清,加入300μL清洗緩沖液重懸。留待上機(jī)檢測(cè)。

CBA試劑盒血清樣本中7種細(xì)胞因子濃度的檢測(cè)加入50μL待測(cè)樣品到流式管中,如上述步驟制備7種捕獲微球的混合液,每管加入50μL混合的捕獲微球,輕輕吹打。室溫孵育1 h。加入50μL混合后的PE標(biāo)記檢測(cè)抗體,輕輕吹打,室溫孵育2 h。加入1 mL 清洗緩沖液,200×g,離心5 min。棄上清,加入300μL清洗緩沖液重懸。留待上機(jī)檢測(cè)。

全血及血清生化指標(biāo)檢測(cè)每例患者抽取2 mL血液,其中1 mL為EDTA抗凝血,經(jīng)Sysmex流水線(xiàn),通過(guò) XE2100全自動(dòng)血液分析儀,得到全血細(xì)胞各種數(shù)據(jù)。另1 mL離心得到上清,留取100μL做CBA檢測(cè),其余經(jīng)德賽診斷試劑盒,并經(jīng)日立7600全自動(dòng)生化儀檢測(cè)C反應(yīng)蛋白。經(jīng)羅氏診斷試劑盒,并經(jīng)Cobase 602全自動(dòng)生化免疫分析儀檢測(cè)降鈣素原。

結(jié)果

人口學(xué)資料本研究共納入穩(wěn)定期哮喘患者共40例,其中輕度持續(xù)哮喘20例,中持續(xù)哮喘20例,平均年齡為42歲,男女比例為1∶1.5。健康人 18例,平均年齡為38歲,男女比例為1∶1。研究納入的哮喘急性發(fā)作期患者為22例,平均年齡為45歲,男女比例為1.2∶1。健康對(duì)照同前。

穩(wěn)定期哮喘患者血清中細(xì)胞因子水平本研究共定制了7種細(xì)胞因子檢測(cè)微球,分別為IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和IFN-γ。其中IL-6主要為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌,在急性感染或組織損傷時(shí)大量釋放;TNF-α為細(xì)胞毒素,在感染、休克或腫瘤性疾病中升高。本研究中穩(wěn)定期哮喘患者(輕度持續(xù),中度持續(xù))血清中IL-6水平分別為:29.09 pg/mL,28.37 pg/mL (vs.健康人,P=0.203);TNF-α分別為(輕度持續(xù),中度持續(xù)):12.36 pg/mL,11.68 pg/mL (vs.健康人,P=0.167)。IL-5,IL-13主要為T(mén)h2型淋巴細(xì)胞分泌,與過(guò)敏性哮喘發(fā)病密切相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定期哮喘與健康人比較無(wú)顯著差異。其中IL-5血清濃度在輕、中度持續(xù)性哮喘分別為10.75 pg/mL和11.99 pg/mL (vs.健康人,P=0.401),IL-13血清濃度在輕、中度持續(xù)性哮喘分別為2.42 pg/mL和2.72 pg/mL (vs.健康人,P=0.438);IL-17和IFN-γ是胞外菌感染時(shí)釋放的細(xì)胞因子,在遲發(fā)型免疫反應(yīng)中可進(jìn)一步趨化單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞到炎癥部位。穩(wěn)定期哮喘血清中IL-17水平分別為30.82 pg/mL和29.16 pg/mL (vs.健康人,P=0.097);IFN-γ水平分別為4.67 pg/mL和4.05 pg/mL (vs.健康人,P=0.103)。IL-10為抑制性細(xì)胞因子,本研究中穩(wěn)定期哮喘血清IL-10水平與健康人無(wú)明顯差異,在輕、中度持續(xù)性哮喘中分別為12.87 pg/mL,13.96 pg/mL (vs.健康人,P=0.078)(表1)。說(shuō)明檢測(cè)穩(wěn)定期哮喘外周血中細(xì)胞因子水平不能反應(yīng)氣道炎癥的類(lèi)型和嚴(yán)重程度。

表1　穩(wěn)定期哮喘患者血清中細(xì)胞因子水平

哮喘急性發(fā)作期血清中細(xì)胞因子水平變化共納入哮喘急性發(fā)作期患者22例,根據(jù)2014年GINA的診斷標(biāo)準(zhǔn)和2013中國(guó)支氣管哮喘防治指南,判斷急性發(fā)作的嚴(yán)重程度。其中輕度急性發(fā)作 4例,中度急性發(fā)作 10例,重度急性發(fā)作8例。每例患者抽取外周血2 mL,血清保存于-80 ℃冰箱,待統(tǒng)一檢測(cè)。若不對(duì)患者進(jìn)行細(xì)分,計(jì)算所有急性發(fā)作哮喘患者外周血中細(xì)胞因子平均水平,發(fā)現(xiàn)僅IL-6和TNF-α明顯升高,分別為(71.79±21.8) pg/mL(vs.健康人,P=0.022)和(84.33±20.8)pg/mL(vs.健康人,P=0.017),其數(shù)據(jù)變異度也較大。其余細(xì)胞因子水平與健康人無(wú)明顯差異(圖1)。仔細(xì)分析原始數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),急性發(fā)作期哮喘細(xì)胞因子升高的模式不盡相同,若定義急性期細(xì)胞因子的絕對(duì)值較健康人升高2倍及以上為明顯增高,可將患者分為5種細(xì)胞因子亞群,分別為IL-6升高型5例(22.8%,5/22),IL-6/TNF-α雙高型3例(13.6%,3/22),IL-5升高型7例(31.8%,7/22),IL-17升高型3例(13.6%,3/22),細(xì)胞因子正常型4例(18.2%,4/22)。

哮喘急性發(fā)作期患者其細(xì)胞因子型與臨床特征的關(guān)系對(duì)穩(wěn)定期哮喘血清中細(xì)胞因子水平的篩查發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期炎癥聚集在氣道局部,全身細(xì)胞因子水平不高(基本與健康人相似)。而哮喘急性發(fā)作期,發(fā)現(xiàn)了5種類(lèi)型的細(xì)胞因子群,且IL-6升高型和IL-6/TNF-α升高型細(xì)胞因子水平大幅度升高,IL-6升高6.28～12倍(較基線(xiàn)水平),TNF-α升高17.3倍(較基線(xiàn)水平)。而IL-5升高型和IL-17升高型輕度升高,其中IL-5升高3倍(較基線(xiàn)水平),

Compared with healthy subjects,(1)P<0.05.

圖1CBA法檢測(cè)哮喘急性發(fā)作期和健康人血清中細(xì)胞因子水平

Fig 1Serum cytokine concentration for acute exacerbation asthma and healthy subjects measured by CBA method

IL-17升高2.01倍(較基線(xiàn)水平)(圖2)。哮喘急性發(fā)作誘發(fā)因素較多,如感染、過(guò)敏原、冷空氣、藥物等,臨床上通常采用癥狀、外周血白細(xì)胞、CRP及降鈣素原(PCT)等來(lái)判斷是否由感染誘發(fā)。我們發(fā)現(xiàn)IL-6升高型、IL-6/TNF-α升高型與白細(xì)胞升高及CRP升高相關(guān)性較好。兩型白細(xì)胞總數(shù)均值為:(10.4～11.5)×109/L,兩者的相關(guān)系數(shù)R=0.63 (P<0.05);而CRP均值為21.6～41.6 mg/L,兩者的相關(guān)系數(shù)R=0.67(P<0.05)。細(xì)胞因子與PCT未見(jiàn)明顯相關(guān)性(表2,圖3)。說(shuō)明IL-6或TNF-α可反映機(jī)體急性感染的狀況。而IL-5升高型,IL-17升高型及細(xì)胞因子正常型的外周血白細(xì)胞及CRP均無(wú)明顯升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無(wú)相關(guān)性(圖3)。說(shuō)明這群患者的哮喘急性發(fā)作并非感染誘發(fā)。

Compared with healthy subjects,(1)P<0.01;(2)P<0.05.

圖2　CBA法檢測(cè)哮喘急性期血清中細(xì)胞因子水平并劃分亞群

Compared with healthy subjeots,(1)P<0.05;(2)P<0.01.

氣道慢性炎癥是所有類(lèi)型哮喘的共同特征,也是其臨床癥狀和氣道高反應(yīng)性的基礎(chǔ)。已知各種炎性細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等均參與了哮喘復(fù)雜氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,由炎癥細(xì)胞釋放的“細(xì)胞因子”一直備受關(guān)注。細(xì)胞因子的臨床研究取材主要為兩大部分,一部分來(lái)自哮喘患者外周血的單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC),另一部分來(lái)自于患者血清/血漿。Leonard等[3]研究了18例過(guò)敏型哮喘,6例其他過(guò)敏癥患者和7例健康人,患者外周血PBMC與屋塵螨、IL-2共孵育,檢測(cè)發(fā)現(xiàn):過(guò)敏性哮喘和患其他過(guò)敏癥的患者,其上清IL-4分泌量大增,而IFN-γ的分泌量低于其他過(guò)敏癥患者,且IFN-γ的量與癥狀嚴(yán)重度成反比。為比較兒童哮喘患者對(duì)常年性過(guò)敏原和季節(jié)性過(guò)敏原的反應(yīng)性。Rudin等[4]共納入了20例塵螨過(guò)敏的哮喘、24例黑麥草過(guò)敏的哮喘,20例對(duì)兩者均過(guò)敏的哮喘及20例健康人,外周血PBMC分別用不同的過(guò)敏原刺激,發(fā)現(xiàn)對(duì)常年性過(guò)敏原(塵螨)過(guò)敏者能誘導(dǎo)分泌Th2型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等),如僅對(duì)季節(jié)性過(guò)敏原(如黑麥草)過(guò)敏者,則不能刺激PBMC分泌Th2型細(xì)胞因子。當(dāng)然也有研究者發(fā)現(xiàn)外周血PBMC對(duì)過(guò)敏原的反應(yīng)性不能鑒別哮喘的類(lèi)別及疾病的狀態(tài)[5]。血清/血漿中細(xì)胞因子研究發(fā)現(xiàn):哮喘急性發(fā)作期和緩解期的IL-4水平明顯增高(與健康人比較),布地奈德霧化吸入后,血清中IFN-γ、IL-2水平增高,而IL-4、IL-10顯著降低[6-7]。在一項(xiàng)對(duì)哮喘不同時(shí)期血清中IL-4、IL-16和內(nèi)皮素受體1(ET-1)的研究中發(fā)現(xiàn),血清IL-4含量在哮喘急性發(fā)作期均高于慢性持續(xù)期、緩解期及正常對(duì)照。而IL-16和ET-1含量在哮喘急性發(fā)作期、慢性持續(xù)期均明顯高于緩解期和正常對(duì)照。提示以上3種炎性因子均參與了哮喘的發(fā)生和發(fā)展,動(dòng)態(tài)測(cè)定IL-4、IL-16和ET-1對(duì)于評(píng)價(jià)哮喘的病情及指導(dǎo)治療有一定價(jià)值[8-9]。由于細(xì)胞因子在哮喘亞類(lèi)判斷、病情評(píng)估和指導(dǎo)治療方面尚存在爭(zhēng)議,我們選取了復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院門(mén)、急診就診的穩(wěn)定期哮喘40例,急性發(fā)作期哮喘22例和健康對(duì)照18例納入研究。雖然哮喘是以T淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞,肥大細(xì)胞為主的氣道慢性炎癥,在哮喘的整個(gè)疾病過(guò)程中一旦遭遇感染還有中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等參與[10]。因此在細(xì)胞因子的選擇上,我們定制了Th2型細(xì)胞因子IL-5,IL-13; Th1型細(xì)胞因子IFN-γ;Th17型細(xì)胞因子IL-17;單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子IL-6,TNF-α;抑制性細(xì)胞因子IL-10,并觀(guān)察各細(xì)胞因子在穩(wěn)定期哮喘和哮喘急性發(fā)作期的水平變化。

本研究包含兩組哮喘患者,一組為慢性持續(xù)期患者,共40例,其血清細(xì)胞因子水平未見(jiàn)升高。Nadi等[11]和Ma等[12]檢測(cè)了重度持續(xù)性哮喘血清及PBMC釋放的IL-22和IL-25水平,也未發(fā)現(xiàn)其與健康人有差異。由此推測(cè)哮喘所具有的持續(xù)性氣道炎主要局限于氣道和肺部,細(xì)胞因子幾乎不釋放到全身。反之,另一組為急性發(fā)作期哮喘,其血清部分細(xì)胞因子升高,其中IL-6升高型、IL-6/TNF-α雙高型占36.4%,因IL-6和TNF-α與急性感染、組織損傷導(dǎo)致的炎癥相關(guān),它可趨化中性粒細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞到炎癥局部,促使急性期時(shí)相蛋白分泌。在放線(xiàn)桿菌誘導(dǎo)的豬肺炎模型中,血漿IL-6、TNF-α的水平在感染后10～20 h明顯增高,并持續(xù)8～72 h不等[13]。肺炎支原體感染的豬肺炎模型中,肺泡盥洗液巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-8和TNF-α水平明顯升高,TNF-α升高與細(xì)菌清除,炎細(xì)胞募集及局部肉芽腫形成關(guān)系密切[14]。且用IL-6基因敲除鼠制備的紅球菌感染模型中,TNF-α量的產(chǎn)生比野生型鼠更高,說(shuō)明IL-6和TNF-α在抗感染方面具有協(xié)同作用[15]。因此我們推測(cè)這兩項(xiàng)細(xì)胞因子升高預(yù)示哮喘急性發(fā)作的誘因與細(xì)菌感染有關(guān)。T淋巴細(xì)胞表面的Toll樣受體(TLR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式后,引起細(xì)胞因子信號(hào)瀑布式傳遞,IL-6或TNF-α通常短期內(nèi)呈指數(shù)樣升高,本研究也發(fā)現(xiàn)IL-6,TNF-α呈高幅上升,分別達(dá)正常的6.28～17.3倍。臨床上通常用白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)來(lái)協(xié)助判斷是否合并細(xì)菌感染,但白細(xì)胞的動(dòng)員和向外周釋放均需要一定時(shí)間,而IL-6和TNF-α通常在急性感染2 h左右上升,對(duì)于外周血白細(xì)胞暫無(wú)升高的急性發(fā)作者,可以快速輔助鑒別。相關(guān)分析顯示,IL-6和TNF-α均與外周血白細(xì)胞及CRP呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.63和0.67(P<0.05)。哮喘急性發(fā)作的誘因多種多樣,如塵螨、花粉、油煙、冷空氣、感染、運(yùn)動(dòng)、藥物等,臨床醫(yī)師從接診到治療決策的時(shí)間很短,而可輔助判斷細(xì)菌感染的指標(biāo)較少。因此,在哮喘急性發(fā)作期是否給予抗生素治療對(duì)醫(yī)師來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。Lee等[16]調(diào)查了香港104例6～14歲兒童哮喘患者的急性發(fā)作(acute exacerbate,AE),其中在97次AE中,單純AE為34.8%(32/97),AE合并感染為65.2%(65/97)。在合并感染中,39.2%被證明為病毒誘發(fā)。雖然研究者并沒(méi)有直接給出細(xì)菌誘發(fā)的哮喘急性發(fā)作,但可推知其比例也不高。因此,合理結(jié)合IL-6、TNF-α、WBC、CRP等指標(biāo)來(lái)綜合判斷是否合并細(xì)菌感染,具有潛在的臨床意義。IL-5升高型和IL-17升高型占急性發(fā)作的45.4%,IL-5為T(mén)h2型細(xì)胞因子,推測(cè)該型急性加重可能由過(guò)敏性因素誘發(fā)。IL-17是由Th17細(xì)胞分泌,它參與胞外菌侵襲引起的遲發(fā)型免疫反應(yīng),這是否與非典型病原體感染相關(guān)還需進(jìn)一步研究。細(xì)胞因子正常型占急性發(fā)作的18.2%。后3種細(xì)胞因子型提示該急性加重可能并非細(xì)菌感染誘發(fā)。

本研究采用CBA法,可檢測(cè)組織培養(yǎng)上清、血清/血漿樣本中可溶性多肽成分,如細(xì)胞因子、趨化因子、免疫球蛋白和過(guò)敏霉素等。包被了抗體的磁珠首先黏附目標(biāo)多肽,將多肽定位在微整列的固定位置上,便于后期識(shí)別,隨即用標(biāo)記熒光的二抗與“磁珠-目標(biāo)多肽”的二聚體結(jié)合,熒光越強(qiáng)說(shuō)明目標(biāo)多肽越多。ELISA也可檢測(cè)可溶性多肽,是檢測(cè)細(xì)胞因子的傳統(tǒng)方法,但ELISA與CBA法比較具有較為耗時(shí)、需要樣本量大等缺點(diǎn)。例如:ELISA法檢測(cè)一項(xiàng)細(xì)胞因子要200μL標(biāo)本,而CBA法僅需16μL。一套完整的ELISA法從包被孔板到出結(jié)果,需要2個(gè)工作日,而CBA法從樣品分離到染色、上機(jī)、分析等僅需5 h。從檢測(cè)靈敏度看,CBA法可檢測(cè)<1.0 pg/mL的細(xì)胞因子,而ELISA至少為10 pg/mL。價(jià)格上雖然一個(gè)CBA試劑盒需要2 000多元,但通過(guò)成套定制可降低成本,且一個(gè)試劑盒可檢測(cè)100個(gè)樣品,單項(xiàng)成本并不昂貴。本研究中ELISA檢測(cè)7個(gè)細(xì)胞因子的價(jià)格為350元左右,而采用CBA法檢測(cè)的成本價(jià)僅為120元。另外,流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)(fluorescence activating cell sorter,FACS)是目前生物醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)和分子醫(yī)學(xué)等的通用技術(shù),它具有靈敏、快捷、多通道的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色可檢測(cè)胞內(nèi)多種蛋白的含量,但FACS不適合用于可溶性介質(zhì)的檢測(cè)。而CBA法正是結(jié)合了微整列和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì),通過(guò)磁珠捕獲,使可溶性介質(zhì)獲得了通過(guò)流式儀的可能,通過(guò)微整列,不同的磁珠出現(xiàn)的位置不同,從而來(lái)識(shí)別特定細(xì)胞因子,它可在微小標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)30多種可溶性介質(zhì),達(dá)到多通量的效果。

因此,CBA法用于栓測(cè)臨床血清標(biāo)本具有快速、微量、價(jià)格適中、便于重復(fù)的優(yōu)勢(shì),且可根據(jù)不同需求靈活定制檢測(cè)試劑盒。細(xì)胞因子水平在慢性持續(xù)期無(wú)明顯升高,說(shuō)明哮喘是氣道和肺的局限性炎癥。而IL-6和TNF-α升高可輔助判斷由細(xì)菌感染誘發(fā)的急性加重[17],并快速指導(dǎo)抗生素的使用。

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The significance of cytometric beads array in detecting serum cytokine level for steady and acute exacerbation asthma

DU Chun-ling1,2, XU Kan3, MIN Zhi-hui4, SU Xiao-qiong1, DONG Nian1, BAI Feng-xi1,CHEN Zhi-hong1△

(1DepartmentofRespiratory,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofRespiratory,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China;3DepartmentofGeriatrics,4ResearchCenter,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect cytokines in serum for chronic asthma and acute exacerbation by cytometric beads array method (CBA), and to analyze characteristics of cytokine subgroup and their relation to clinical data.MethodsFourty chronic asthma,22 acute exacerbation of asthma and 18 healthy subjects were included.A little amount of blood was drawn from each subject (2 mL) and used for measuring cytokines by CBA to analyze their characteristics and correlation with clinical data.Regular blood test,C reaction protein and procalcitonin were measured by full automatic blood cell and biochemical analyzer.ResultsCBA kit of cytokine panels were custom-made,which included IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,TNF-α and IFN-γ.No differences were found in cytokine levels in chronic asthma when compared with healthy subjects.However, in acute exacerbation phase,there were 5 cytokine subgroups which were high IL-6 (22.8%),high IL-6/TNF-α(13.6%),high IL-5 (31.8%),high IL-17(13.6%) and normal cytokine (18.2%).The levels of IL-6 and TNF-α increased 6.28-12 folds and 17.3 folds respectively compared with healthy subiects. High IL-6 and High IL-6/TNF-α were positively correlated with WBC and CRP (R2=0.63,R2=0.67:P<0.05).Conclusion CBA was a reliable way to detect muti-cytokines in asthma serum in a short time.No differences were found in cytokine levels in chronic asthma.However,the specific cytokine panel (IL-6,TNF-α,WBC and CRP) may be helpful to identify the acute exacerbation caused by bacterial and guide appropriate antibiotic therapy.【Key words】cytokine;asthma;cytometric beads array method

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 453.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.004

(收稿日期:2015-06-12;編輯:王蔚)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81270078,81470211)

△Corresponding authorE-mail:czh60@hotmail.com