溶磷菌混施對土壤微生物群落及毛竹生長的影響

劉耀輝，盛可銀，羅建榮，鄭淇元，王 菲，修玉冰，張玉文，胡冬南，張文元*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/江西省森林培育重點實驗室，江西 南昌 330032；2.江西省貴溪市國有林場，江西 鷹潭 335413）

【研究意義】磷是組成生命體的重要營養(yǎng)元素之一，在生物體的生長、發(fā)育和繁殖過程中扮演著重要的角色[1-2]。在熱帶和亞熱帶紅壤區(qū)，土壤磷限制現(xiàn)象尤為突出，由于土壤中的磷素與鐵、鋁等金屬氧化物結(jié)合形成沉淀或絡(luò)合物而難以被植物直接吸收和利用，嚴(yán)重制約陸地生態(tài)系統(tǒng)凈初級生產(chǎn)力[3-6]。因此，活化土壤磷素，提高其利用率是亟待解決的問題?！厩叭搜芯窟M展】溶磷微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要微生物組分，是土壤磷素循環(huán)和轉(zhuǎn)化的主要執(zhí)行者[7]。磷酸酶的礦化和土壤功能微生物的富集等都是溶磷微生物活化土壤磷素的重要途徑[8-10]。溶磷微生物能分泌胞外酶（磷酸酶）礦化土壤有機磷，提高有效磷含量，有利于植物吸收利用[11]。而土壤磷酸酶的表達往往受磷循環(huán)功能基因的調(diào)控，如phoC和phoD基因分別編碼酸性磷酸酶和堿性磷酸酶，但其豐度和表達量也受土壤有機磷底物濃度及無機磷含量的影響[7,12-13]。溶磷微生物還能通過富集功能微生物和促進磷循環(huán)基因表達，使土壤磷素向有利于植物吸收和利用的形態(tài)轉(zhuǎn)化，加速植物生物量的積累[14]。研究表明，溶磷菌Pantoea agglomerans（團聚假單胞桿菌）單獨接種能降低農(nóng)田土壤pH，改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成，富集Firmicutes（厚壁菌門）轉(zhuǎn)化土壤磷素，提高土壤有效磷含量[15]。Wei等[16]研究證明不同微生物物種在磷素的地球化學(xué)循環(huán)過程中扮演著重要的角色。溶磷微生物還能定殖于植物根系，持續(xù)性地發(fā)揮溶磷、植物促生作用[17]。此外，溶磷微生物還能分泌低分子量有機酸釋放與金屬氧化物結(jié)合的難溶性磷而達到活化土壤磷素、增強磷素利用率的效果[9,18]。毛竹（Phyllostachys edulis（Carr.）H.de Lehaie）具有生長快、成材早、經(jīng)濟高等特點，分布面積超460 萬hm2[19-20]，是我國南方地區(qū)重要的森林資源，也是農(nóng)民創(chuàng)收的重要森林資源[21]。但南方紅壤區(qū)土壤肥力低下，低磷低利用問題尤為突出，由于土壤磷素與土壤鐵、鋁等金屬礦物形成沉淀或絡(luò)合物，很難被毛竹直接吸收和利用[22]，較低的有效磷含量成為毛竹林生長的主要限制因素之一。

【本研究切入點】而施用溶磷菌能有效緩解這一問題，前人研究證明溶磷微生物單獨施用提高了盆栽毛竹土壤有效磷含量，促進了毛竹生物量的積累[22]。楊豆等[23]研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌Talaromyces aurantiacusIXBR04（菌金黃藍(lán)狀菌JXBR04）主要通過增加鹽酸磷和氯化鈣磷來增強土壤有效磷的供給，而不是通過增加磷酸酶活性礦化有機磷補充有效磷，以此增加毛竹生物量。研究還表明溶磷菌Acinetobacterpittiigp-1（不動桿菌gp-1）增加了土壤磷酸酶、植酸酶活性礦化土壤有機磷，提高有效磷含量，或增加phoD、pstS和gcd（磷循環(huán)功能基因）的豐度提高有效磷含量[24]。此外，研究表明溶磷菌復(fù)合菌液在土壤磷素活化和植物促生方面優(yōu)于單獨施用，如溶磷菌復(fù)合液[BacillusPSM01（芽孢桿菌PSM01）+PaenibacillusPSM16（類芽胞桿菌PSM16）+PseudomonasPSM12（假單胞桿菌PSM12）]處理下植物根際土壤有效磷含量顯著高于溶磷菌單獨施用（PSM01，PSM16，PSM12分別接種）處理[25]，但溶磷菌復(fù)合液對土壤磷素的轉(zhuǎn)化機制尚不明確，如溶磷菌復(fù)合液如何調(diào)控磷循環(huán)功能基因?qū)ν寥懒姿氐霓D(zhuǎn)化及其微生物機制又是如何，更需進一步探究。因此，本文通過盆栽試驗，以毛竹為研究對象，接種不同溶磷微生物復(fù)合菌液，測定毛竹土壤養(yǎng)分、微生物群落和毛竹理化指標(biāo)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探究溶磷微生物復(fù)合菌液對毛竹生長、土壤化學(xué)性質(zhì)、磷循環(huán)功能基因相對豐度及微生物群落的影響，揭示溶磷微生物復(fù)合液的溶磷機制及其對毛竹的促生機理，旨在為改善土壤磷素營養(yǎng)和為亞熱帶地區(qū)科學(xué)施肥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：以毛竹根際土壤中篩選的3 株溶磷菌為試驗菌株：勞爾菌屬（Ralstoniasp.），克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）和腸桿菌屬（Enterobactersp.）。分別對3株溶磷菌進行純化、復(fù)壯、離心、稀釋（細(xì)胞數(shù)約1×108CFU/mL），并等比例混合配置成復(fù)合菌液待用。

培養(yǎng)基：溶菌肉湯培養(yǎng)基（Lysogeny broth，LB）：胰蛋白胨15 g，酵母提取物5 g，氯化鈉15 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL，pH 7.4。

供試土壤：盆栽供試紅壤采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)毛竹林（28°45′N，114°24′E），自然風(fēng)干，過2 mm 篩。土壤基本化學(xué)性質(zhì)：pH 5.42，速效磷3.17 mg/kg，銨態(tài)氮1.42 mg/kg，硝態(tài)氮0.27 mg/kg，速效鉀89.34 mg/kg，全磷0.31 g/kg，全氮1.45 g/kg，全鉀19.51 g/kg，有機質(zhì)19.83 g/kg。

供試植物：兩年生毛竹實生幼苗，選用生長健壯、根系、形態(tài)相似的毛竹幼苗移植。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗設(shè)計 本試驗采用完全隨機試驗設(shè)計，設(shè)置4 種溶磷菌復(fù)合液：勞爾菌+克雷伯氏菌（PRK），勞爾菌+腸桿菌（PRE），克雷伯氏菌+腸桿菌（PKE），勞爾菌+克雷伯氏菌+腸桿菌（PRKE），空白對照（CK），共5種處理，每種處理重復(fù)3盆，共15盆。每盆裝干土5 kg，移栽毛竹幼苗一株。以根際澆灌的方式分3次接種復(fù)合菌液（每隔5 d 1次），每次20 mL，空白對照加等量體積的去離子水，在溫室大棚內(nèi)培育90 d（距最后一次接種時間）后收獲取樣。盆栽土壤濕度維持在土壤最大田間持水量65%左右，溫度約24 ℃。

1.2.2 樣品采集與分析 盆栽毛竹幼苗生長90 d后，用游標(biāo)卡尺測定其苗高（地上部分）和地徑；采用酒精提法測定毛竹葉片葉綠素含量；毛竹根系活力用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定[26]；將毛竹幼苗在105 ℃下殺青45 min，80 ℃下烘干至恒重，測定生物量；用抖根法收集毛竹根際土壤，除去石礫、雜物等，過2 mm篩。土壤分為3部分，分別用于土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤酶活性測定和高通量測序。土壤化學(xué)性質(zhì)參考章家恩主編的《生態(tài)學(xué)常用施用研究方法與計算》進行測定[27]。土壤pH值（土∶水=1∶2.5）用pH計測定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用全自動流動分析儀（SmartChem，Brookfield，USA）測定；土壤有效磷用鉬銻抗比色法測定；用火焰光度計（F-100 flame photometer，Shanghai，China）分析土壤速效鉀含量；土壤磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定；土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色分析；用3，5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性。

1.2.3 土壤DNA 提取和Illumina 高通量測序分析 取鮮土0.5 g，根據(jù)DNA 試劑盒（Mag-Bind Soil DNA Kit，Yanmu，Shanghai，China）指導(dǎo)書提取土壤總DNA。用0.8%的瓊脂凝膠電泳鑒定DNA 的純度和完整性，用Qubit熒光計（Thermo Fisher Scientific-CN，Beijing，China）對DNA 進行定量分析。然后送到北京諾禾致源科技股份有限公司在Illumina PE150 平臺（Novogene Biotechnology CO.，Ltd，Beijing，China）進行雙端高通量測序，得到82.11G原始數(shù)據(jù)（raw data）。根據(jù)默認(rèn)參數(shù)對序列進行質(zhì)控，去除低質(zhì)量堿基（質(zhì)量值≤38）、鑲嵌、重疊的reads（≤15 bp），過濾宿主的reads，得到Clean data。用MEGAHI軟件對Clean data混合組裝，過濾≤ 500 pb 的片段，得到Scaftigs 用于后續(xù)基因預(yù)測。用MetaGeneMark 軟件采用默認(rèn)值對優(yōu)化的Scaftigs 進行ORF（Open Reading Frame）預(yù)測，應(yīng)用Bowtie 2 軟件對各樣品的Clean data 比對至初始gene catalogue，計算得到基因在各樣品中比對上的reads 數(shù)目，用于后續(xù)分析。用Diamond 軟件和MEGAN6 軟件對優(yōu)化的序列與NCBI 的NR 數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋土壤微生物信息，與KEGG 數(shù)據(jù)庫進行比對，注釋磷循環(huán)功能基因[27]。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用Excel 2019軟件對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，用Sigmaplot 14.0和Canoco 5軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合溶磷菌液對毛竹生長、葉綠素含量及根系活力的影響

由表1 可知，毛竹的苗高、地徑在溶磷菌混施處理后顯著增加，其生物量也顯著增加（P＜0.05），且較空白對照的毛竹生物量分別增加157.27%（PRK），121.03%（PRE），148.86%（PKE）和323.94%（PRKE）；溶磷菌接種顯著增加毛竹葉片葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素的含量，且在PRKE 處理下含量最高，分別為81.57，25.81，107.38 mg/g；毛竹根系活力在接種溶磷菌混施后也呈現(xiàn)不同程度提升，約為對照的1.33（PRK）、1.57（PRE）、1.56（PKE）和1.93（PRKE）倍。此外，毛竹苗高、地徑、生物量、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及根系活力均在PRKE處理下最高，表示3株溶磷菌混合接種對毛竹的促生效果最佳。

表1 復(fù)合菌液對毛竹生長指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of complex bacterium inoculation on growth of Moso bamboo

2.2 復(fù)合溶磷菌液對土壤速效養(yǎng)分、pH及酶活性的影響

與CK 相比，PRK 處理顯著提高了土壤pH（P＜0.05）；且其他處理均有提升土壤pH 的潛力（表2）；溶磷菌接種顯著提高了土壤有效磷含量，其在PRK、PRE、PKE 和PRKE 處理下的有效磷含量分別為4.85、4.83、5.20 和5.64 mg/kg。PRKE、PKE 和PREK 處理顯著增加土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量（P＜0.05），且均在PRKE 處理下最高，分別為5.64 mg/kg 和1.11 mg/kg，表明其有利于土壤氮素礦化；土壤速效鉀含量也在PRKE、PKE和PREK處理下顯著增加（P＜0.05），表明溶磷菌釋放了土壤母質(zhì)中的鉀素。

土壤酸性磷酸酶活性在溶磷菌混施下呈增加趨勢：PRKE[1 036.87 μg/（g·d）]＞PKE[498.04 μg/（g·d）]＞PRE[497.73 μg/（g·d）]＞PRK[436.45 μg/（g·d）]＞CK[341.75 μg/（g·d）]（圖1a）；溶磷菌混施促進了土壤堿性磷酸酶的表達，其活性分別是空白對照的1.46（PRK）、1.62（PRE）、2.38（PKE）和1.85（PRKE）倍（圖1b）。因此，溶磷菌混施通過促進土壤磷酸酶表達將有機磷礦化為無機磷，提高土壤有效磷含量。同酸性磷酸酶活性增長趨勢相似，土壤蔗糖酶活性在溶磷菌混施后也呈上升趨勢，其活性在PRKE 處理下最高[48.27 μg/（g·d）]（圖1c）；溶磷菌混施對土壤脲酶活性也有不同程度的促進作用，其活性在PRE 和PRKE處理后顯著高于空白對照（圖1d）。

圖1 復(fù)合溶磷菌液對土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of complex bacterium inoculation on soil enzyme activity

2.3 復(fù)合溶磷菌液對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

圖2a表明，Proteobacteria（變形菌門）和Acidobacteria（酸酐菌門）是毛竹根際土壤中主要的兩大菌門，占微生物總相對豐度的55.91%～58.38%。變形菌門相對豐度在PRK 處理中顯著高于PRE 處理（圖2b）（P＜0.05），而PRKE 處理顯著增加Nitrospirae（硝化螺旋菌門）和Verrucomicrobia（疣微菌門）的相對豐度（圖2c和圖2d）（P＜0.05）。Cyanobacteria（藍(lán)細(xì)菌）相對豐度在PRKE處理下富集度最高，但其他處理均抑制了其相對豐度，PRK 和PKE 處理尤為顯著（P＜0.05）（圖2e）。主成分分析（PCA）解釋了土壤微生物群落總變異度的79.76%。

屬水平下，溶磷菌混施使Sphingomonassp.（鞘脂單胞菌屬）在盆栽毛竹根際富集（圖3a），且顯著改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，PCA1和PCA2分別解釋了微生物群落（屬水平）總變異度的99.29%和0.38%（圖3b）。

由圖3c 可知，勞爾菌屬相對豐度在PRK、PKE 和PRKE 處理后顯著增加，但PRE 處理對其無顯著影響（P＜0.05）；與空白對照相比，腸桿菌屬相對豐度在PRK、PRE、PKE 和PRKE 處理后分別增加80.84%、33.53%、17.36%和188.92%；克雷伯氏菌屬在毛竹根際富集度相對較高，分別為：0.44×10-4（CK），4.96×10-4（PRK），25.20×10-4（PRE），29.70×10-4（PKE），54.00×10-4（PRKE）。因此，溶磷菌混施增加了勞爾菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的相對豐度。

圖3 復(fù)合菌液對土壤微生物（屬水平）群落的影響Fig.3 Effects of complex bacterium inoculation on soil microbial community（genes level）

2.4 復(fù)合溶磷菌液對磷循環(huán)功能基因的影響

溶磷菌混施顯著改變了土壤磷轉(zhuǎn)運基因的相對豐度（圖4）。調(diào)控土壤無機磷溶解和有機磷礦化基因相對豐度分別比磷饑餓相關(guān)基因及磷吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因相對豐度增加了438.66%和383.15%，表明溶磷菌混施有利于無機磷溶解和有機磷礦化基因的表達，進而促進磷酸酶表達（圖1a和圖1b）礦化土壤有機磷。酸性磷酸酶基因phoN相對豐度從PRK、PRE、PKE 至PRKE 處理表現(xiàn)為上升趨勢，與土壤酸性磷酸酶活性增長趨勢相似；堿性磷酸酶基因phoD/A相對豐度在PRE 最低為10.32，但在PRK 處理下豐度最高為10.96。溶磷菌混施對調(diào)控磷饑餓相關(guān)基因及磷吸收和收轉(zhuǎn)運相關(guān)基因相對豐度改變程度不同，但與空白對照相比均無顯著差異（P＜0.05）。

圖4 復(fù)合菌液對磷循環(huán)功能基因的影響Fig.4 Effects of complex bacterium inoculation on the relative abundance of phosphorus transformation functional gene（genes level）

2.5 毛竹生長與土壤化學(xué)性質(zhì)、磷循環(huán)功能基因及微生物群落間的相關(guān)性

如圖5 所示，土壤銨態(tài)氮含量與變形菌門相對豐度顯著正相關(guān)，但與硝化螺旋菌門相對豐度顯著負(fù)相關(guān)；土壤硝態(tài)氮含量與脲酶活性顯著正相關(guān)（P＜0.05）；土壤堿性磷酸酶活性與有效磷含量、phoD基因相對豐度呈顯著正相關(guān)，但土壤酸性磷酸酶活性與phoN基因相對豐度呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。此外，土壤有效磷含量與phnX、phnW、phoU 和phoA基因相對豐度呈正相關(guān)，但與phoN、phoB、ppa、gcd基因呈顯著負(fù)相關(guān)，表明這些基因可能參與了土壤有效磷的轉(zhuǎn)化。

圖5 土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性與微生物群落結(jié)構(gòu)（a），磷循環(huán)功能基因性對豐度（b）冗余分析Fig.5 RDA revealed the correlation among soil chemical properties，enzyme activities and microbial community structure（a），and phosphorus transforming functional genes（b）

相關(guān)性分析表明，土壤有效磷、無機氮（銨態(tài)氮和硝態(tài)氮）含量均與毛竹根系活力、葉片葉綠素a、葉片葉綠素b、總?cè)~綠素及生物量顯著正相關(guān)（P＜0.05）（表3），表明溶磷菌接種促進了毛竹根系對土壤速效養(yǎng)分的吸收，加速毛竹生物量的積累。此外，腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬（除磷饑餓反應(yīng)調(diào)控相關(guān)基因）相對豐度與磷循環(huán)功能基因顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），勞爾菌屬相對豐度與磷循環(huán)功能基因無顯著相關(guān)性，但極顯著增加了土壤酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶的活性（P＜0.01）。

表3 毛竹生長指標(biāo)和接種菌株相對豐度與土壤理化性質(zhì)、酶活性及磷循環(huán)功能基因的相關(guān)性Tab.3 Correlation analysis between Moso bamboo growth，inoculated strains relative abundance and soil physicochemical properties，enzyme activities and phosphorus transforming functional genes

3 討論

3.1 復(fù)合溶磷菌液對土壤養(yǎng)分、酶活性、毛竹生物量及其生理指標(biāo)的影響

溶磷菌作為有益微生物，能活化土壤磷素、提高有效磷含量[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，溶磷菌混合接種顯著提高了土壤有效磷含量。研究結(jié)果與楊豆等研究發(fā)現(xiàn)相似[23]。這是由于溶磷菌增加了土壤磷酸酶的活性，礦化土壤有機磷，補充無機磷庫[29-30]。但楊豆等[23]研究表明溶磷菌對毛竹土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性無顯著影響，有效磷含量比空白對照增加了78.30%。本試驗結(jié)果表明，土壤酸性磷酸酶活性在PRK、PKE 和PRE 處理下與對照相比均無顯著差異，但土壤有效磷含量增量較高，這是因為土壤堿性磷酸酶主導(dǎo)了土壤有機磷的礦化，由于堿性磷酸酶活性較高，且與土壤有效磷含量顯著正相關(guān)。此外，PKE 處理下土壤堿性磷酸酶活性顯著高于其他處理，可能是由于克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬間具有協(xié)同效應(yīng)，而勞爾菌屬與腸桿菌屬或克雷伯氏菌屬間可能存在潛在拮抗效應(yīng)，但其中的機制需要進一步研究。

土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在溶磷菌混施下均有不同程度的增加，這可能是溶磷菌接種促進土壤脲酶礦化土壤有機氮；或增加土壤蔗糖酶分解土壤多糖，釋放無機態(tài)氮，從而提高了土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。此外，土壤微生物在氮素的循環(huán)過程中也扮演著重要角色，如微生物分解有機質(zhì)釋放氮素、變形菌門能固定大氣中的氮素，將其轉(zhuǎn)化為無機態(tài)氮等[31]。

溶磷菌混施增加了土壤速效養(yǎng)分含量，促進毛竹吸收，顯著增加了毛竹苗高、地徑及生物量。毛竹根系吸收的一部分養(yǎng)分被運輸?shù)饺~片，用于合成光合作用的底物，如氨基酸、蛋白質(zhì)等；磷素能合成腺苷三磷酸（ATP），水解后提供能量；或合成葉綠素等[32-33]。本試驗結(jié)果表明土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有效磷含量與毛竹葉片葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量顯著正相關(guān)。因此，溶磷菌混施通過提高葉綠素a和葉綠素b含量間接增強毛竹葉片光合作用，加速毛竹生物量的合成。此外，毛竹葉片葉綠素a和葉綠素b含量還與根系活力呈正相關(guān)關(guān)系。這是由于植物光合作用的產(chǎn)物被運輸?shù)礁看龠M毛竹須根系伸展、生長，間接提高根系活力[34]。

3.2 土壤微生物群落對復(fù)合溶磷菌液的響應(yīng)

外源微生物的引入可直接或間接改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[35]。土壤礦質(zhì)養(yǎng)分和pH是驅(qū)動土壤微生物群落的主要因素。大量研究表明，酸桿菌門是降低土壤pH的主要微生物物種[35]。本試驗中，酸酐菌門相對豐度在勞爾菌屬和克雷伯氏菌屬處理后略微降低，這可能是導(dǎo)致土壤pH 顯著提高的主要因素，且RDA也證明pH與土壤酸酐菌門相對豐度顯著負(fù)相關(guān)。此外，毛竹盆栽土壤中變形菌門和酸酐菌門相對豐度較高，與Zhang 等[31]研究結(jié)果相似，表明變形菌門和酸酐菌是毛竹林土壤主要的微生物物種。但嚴(yán)淑嫻等[36]研究發(fā)現(xiàn)放線菌門是毛竹林土壤第一優(yōu)勢菌門，這是由于放線菌門能適應(yīng)于較高的pH。而本試驗紅壤為弱酸性，抑制了放線菌門的活性。此外，土壤養(yǎng)分、溫度和外源溶磷菌接種等也是影響其豐度的重要因素。研究表明，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量也在PRKE 處理下最高，且土壤硝化螺旋菌門和疣微菌門相對豐度在PRKE處理下也顯著富集，這是因為這兩種微生物菌門與土壤氮素的循環(huán)相關(guān)。土壤硝化螺旋菌門和疣微菌門能分解土壤有機質(zhì)，釋放無機營養(yǎng)元素；亞硝化單胞菌能轉(zhuǎn)化土壤氮素，提高硝態(tài)氮含量等[16-17,31]。

溶磷菌顯著改變了屬分類學(xué)水平的群落結(jié)構(gòu)，其群落結(jié)構(gòu)在3株溶磷菌混合接種時顯著偏離其他處理。這是由于多種因素導(dǎo)致：（1）土壤有效磷、鉀，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均在3株溶磷菌混合處理下均最高，為微生物生命活動提供豐富的速效養(yǎng)分；（2）溶磷菌接種使勞爾菌屬與克雷伯氏菌屬在毛竹根際顯著富集，腸桿菌屬相對豐度在PRKE 處理下比CK 增加了188.92%，鞘脂單胞菌屬相對豐度也增加了18.71%，這些毛竹根際富集的土壤微生物直接影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[7]，此外，富集的微生物物種還會與土壤其他微生物競爭土壤養(yǎng)分，間接影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；（3）土壤酶活性也在3株溶磷菌混合處理下顯著增加，在一定程度上反映了土壤微生物具有較高的活性[37]；（4）土壤有機質(zhì)含量、毛竹根系分泌物等都是影響土壤微生物群落的重要因素，因為有機質(zhì)和根系分泌物能為土壤微生物提供必要的底物和能量[31]。

前人研究表明，勞爾菌屬常見于土壤土傳病，不利于植物生長發(fā)育[38]。本試驗中，勞爾菌屬相對豐度在PRE、PKE 和PRKE 處理下顯著增加，且與銨態(tài)氮、酸性磷酸酶、脲酶及蔗糖酶活性顯著正相關(guān)。這可能是勞爾菌屬誘導(dǎo)毛竹根系分泌大量有機物質(zhì)，并誘導(dǎo)土壤微生物或毛竹根系分泌胞外酶，轉(zhuǎn)化根系分泌物，提高土壤礦質(zhì)養(yǎng)分[37-38]?？死撞暇鷮俸湍c桿菌屬為常見溶磷微生物物種，有利于土壤磷素的增溶[7]。本試驗結(jié)果表明，克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬均與土壤磷轉(zhuǎn)運基因相對豐度顯著負(fù)相關(guān)，但與土壤磷素和磷酸酶活性無顯著相關(guān)性?？赡苁怯捎诮臃N的克雷伯氏菌和腸桿菌在其屬分類學(xué)水平上處于劣勢，導(dǎo)致這些微生物并非都能編碼磷循環(huán)功能基因。因此，即使克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬和勞爾菌屬在盆栽毛竹土壤中富集程度不同，但并不能充分證明其在毛竹土壤中定植，需要用熒光標(biāo)記法等技術(shù)進一步研究。

3.3 復(fù)合溶磷菌液對磷循環(huán)功能基因的影響

磷循環(huán)功能基因在調(diào)控土壤磷素的循環(huán)中扮演著重要的角色，在磷限制條件下，磷循環(huán)功能基因會被調(diào)動轉(zhuǎn)化土壤磷素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤無機磷溶解和有機磷礦化基因相對豐度分別比磷饑餓相關(guān)基因和磷吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因相對豐度增加了438.66%和383.15%，表明溶磷菌接種有利于土壤有機磷的礦化。因此，土壤磷酸酶活性和有效磷含量均有不同程度的增加。土壤堿性磷酸酶活性表現(xiàn)為增加趨勢，與phoD基因相對豐度顯著正相關(guān)，與Fraser 等[13]研究結(jié)果相似。但Tan 等[39]證明phoD基因豐度與土壤堿性磷酸酶活性顯著負(fù)相關(guān)。導(dǎo)致不同結(jié)果的主要因素是土壤磷素的盈余和赤字。在磷盈余條件下，較高的有效磷含量會降低土壤磷酸酶的活性，進而抑制phoD基因的表達；磷限制情況下，phoD基因編碼堿性磷酸酶水解土壤有機磷，提高有效磷含量[39]。相反，土壤phoN基因相對豐度與土壤酸性磷酸酶活性和有效磷含量顯著負(fù)相關(guān)。這是由于植物根系分泌物也是土壤磷酸酶來源的途徑之一[40]，溶磷菌能誘導(dǎo)毛竹根系分泌磷酸酶礦化土壤有機磷，提高有效磷含量，從而抑制phoN基因的表達。此外，磷饑餓調(diào)控基因phoR、phoB及高親和性磷酸準(zhǔn)予蛋白pstS/C/A/B的相對豐度與土壤有效磷含量顯著負(fù)相關(guān)，進一步證明土壤磷素處于盈余狀態(tài)[28]。因此，溶磷菌接種提高了土壤有效磷含量，滿足毛竹生長發(fā)育所需的含量。較低磷饑餓基因相對豐度也進一步證實土壤磷素處于盈余狀態(tài)。

4 結(jié)論

溶磷菌混施后，土壤無機磷溶解和有機磷礦化基因相對豐度分別比磷饑餓相關(guān)基因及磷吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)基因相對豐度增加438.66%和383.15%，且磷酸酶活性也表現(xiàn)出不同程度增幅，促進土壤磷酸酶礦化有機磷，增加有效磷含量；溶磷菌混施還提高了土壤速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量，改變了土壤pH，進而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；此外，土壤速效養(yǎng)分的增加有利于毛竹的吸收利用，從而增加毛竹生物量，且毛竹根系活力及葉綠素含量的增加也是加速毛竹生物量積累的重要途徑；與空白對照相比，溶磷菌接種顯著增加了毛竹生物量，且3 株溶磷菌混合接種下毛竹生物量最大。因此，3 株溶磷菌混合接種更有利于土壤磷素的活化及毛竹生物量的合成。

致謝：中央財政項目（JXTG(2020)25）同時給予了資助，謹(jǐn)致謝意！