銀杏葉提取物對(duì)非酒精性脂肪性肝病肝組織TGFβ1、NF-κB、FN表達(dá)的影響

王家員，樊建霜，吳亮，黃卡特，王蓉蓉

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院　中藥房，浙江　溫州　325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江　溫州　325015）

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銀杏葉提取物對(duì)非酒精性脂肪性肝病肝組織TGFβ1、NF-κB、FN表達(dá)的影響

王家員1，樊建霜1，吳亮2，黃卡特2，王蓉蓉2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院中藥房，浙江溫州325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江溫州325015）

［摘 要］目的：觀察銀杏葉提取物（EGB）對(duì)糖尿病大鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：雄性SD大鼠30只隨機(jī)均分成正常對(duì)照組、2型糖尿病組和EGB治療組。采用高脂飲食加小劑量（30 mg/kg）鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型，EGB治療組給予50 mg?kg-1?d-1的EGB連續(xù)灌胃12周。HE染色光鏡下觀察肝組織的形態(tài)學(xué)改變；VG染色光鏡下觀察肝臟組織的纖維化病變；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB P65）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、纖維連接蛋白（FN）以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)肝組織NF-κB、TGFβ1、FN mRNA表達(dá)。結(jié)果：糖尿病大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性、氣球樣變、炎癥以及肝纖維化等NAFLD的病理變化；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示糖尿病大鼠肝組織出現(xiàn)較多的α-SMA陽性表達(dá)的活化的肝星形細(xì)胞（HSC），NF-κB P65、TGFβ1、FN蛋白表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05），部分肝細(xì)胞NF-κB P65呈核陽性表達(dá)；RT-PCR顯示糖尿病大鼠肝組織TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05）。經(jīng)EGB治療后，肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變及炎癥現(xiàn)象得到明顯改善，纖維化程度明顯減輕；肝組織α-SMA陽性表達(dá)的活化的HSC數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；NF-κB P65、TGFβ1、FN蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）；TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)也明顯下降（均P＜0.05）。結(jié)論：EGB可明顯減輕糖尿病大鼠NAFLD的程度，其機(jī)制可能與抑制肝臟NF-κB、TGFβ1、FN的表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］糖尿病，2型；非酒精性脂肪性肝病；銀杏葉提取物；大鼠

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是2型糖尿病主要的并發(fā)癥，疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌［1］。Targher等［2］進(jìn)行了大樣本病例研究，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病并發(fā)NAFL率高達(dá)69.5%。Dixon等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病合并NAFL的患者中約有60%存在著NASH，約有75%的患者存在進(jìn)展性肝纖維化等。銀杏葉提取物（extract of ginkgo biloba，EGB）是由銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯組成的制劑，其藥理作用主要為清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、改善微循環(huán)等［4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立2型糖尿病性NAFLD大鼠模型，用EGB進(jìn)行治療，觀察大鼠肝臟病理變化，檢測(cè)肝組織的核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（NF-κB）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、纖維連接蛋白（FN）基因mRNA以及蛋白表達(dá)水平，探討EGB治療NAFLD的作用機(jī)制。

1　材料和方法

1．1動(dòng)物分組及處理 SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物準(zhǔn)字號(hào)：SCXK（浙）2015-0004，體質(zhì)量140～180 g，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、2型糖尿病組和EGB治療組。2型糖尿病組和EGB治療組喂以高脂飼料（飼料組成：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料）1個(gè)月，誘發(fā)胰島素抵抗。大鼠在禁食12 h后按30 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液內(nèi)，pH=4.0），注射后72 h測(cè)空腹血糖，≥8 mmol/L為造模成功［5］。正常對(duì)照組腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。造模成功后EGB治療組按50 mg?kg-1?d-1劑量灌胃EGB（批號(hào)：20060325，寧波市中藥制藥廠），正常對(duì)照組及2型糖尿病組灌服等容積0.9%氯化鈉溶液，每天1次。EGB治療組及2型糖尿病組在治療期間仍喂高脂飲食，正常對(duì)照組予普通飲食。3組動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12 h后，股動(dòng)脈放血處死大鼠。

1.2血糖、血脂、血胰島素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平的測(cè)定 分別取上述3組大鼠，股動(dòng)脈放血處死，取血3 mL，室溫凝固約25 min，1 500 r/min離心20 min，分離血清，用日立7600大型生化分析儀檢測(cè)血葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、ALT、AST水平（試劑盒購自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司），放射免疫法檢測(cè)血胰島素水平（試劑盒購自北京中國原子能研究所）。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按說明書操作。

1.3肝臟病理變化檢查

1.3.1HE染色及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：取新鮮肝臟組織1塊（約10 mm×10 mm×2 mm），置于10%中性甲醛溶液中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度為3 μm切片，行HE染色，中性樹膠封固。隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×200），按下列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）：①肝細(xì)胞脂肪變：0分（＜5%）；1分（5%～33%）；2分（34%～66%）；3分（＞66%）。②小葉內(nèi)炎癥（200倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）：0分（無）；1分（＜2個(gè)）；2分（2～4個(gè)）；3分（＞4個(gè)）。③肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。

1.3.2膠原纖維VG染色及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：肝臟組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，置入VG染液（1%酸性品紅溶液︰苦味酸飽和水溶液=1︰9臨用前混合）中染色2～3 min。蒸餾水速洗，迅速脫水或晾干。透明，封固。結(jié)果判定：膠原纖維呈紅色，肝細(xì)胞呈黃色。隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野（×100），按下列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肝組織纖維化進(jìn)行分期［1］：0：無纖維化；1：肝小葉3區(qū)竇周或匯管區(qū)周圍纖維化；2：肝小葉3區(qū)竇周合并匯管區(qū)周圍纖維化；3：橋接纖維化；4：高度可疑或確診肝硬化。

1.4免疫組織化學(xué)IHC染色（Envision二步法） 肝組織石蠟切片，嚴(yán)格按Envision二步法說明書進(jìn)行操作。NF-κB P65、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）為鼠單抗（稀釋濃度為1︰100），TGFβ1為兔多抗（稀釋濃度1︰100），F(xiàn)N為兔多抗。一抗及二抗均購于北京中杉金橋生物試劑有限公司。以0.01 mol/L的磷酸緩沖液（PBS）代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照。結(jié)果判定：胞漿呈棕黃色為陽性表達(dá)。隨機(jī)選擇5個(gè)低倍鏡視野（×100），應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計(jì)算NF-κB P65、TGFβ1、FN累積光密度，按下列評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估α-SMA的表達(dá)［7］：0：無著色；1：輕度（＜10%）；2：中度（11%～25%）；3：重度（26%～50%）；4：極重度（＞50%）。

1.5半定量RT-PCR 取新鮮肝組織100 mg加1 mL Trizol（購自美國Invitrogen公司），提取大鼠肝組織的總RNA。取2 μg總RNA，用M-MLV（購自Promega公司）反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA（20 μL）。取1 μL cDNA作為模板，在Taq DNA聚合酶（購自大連寶生物公司）催化下行目的基因NF-κB、TGFβ1、FN和內(nèi)參基因RPS16的PCR同管擴(kuò)增。PCR引物由上海Invitrogen公司合成。PCR引物及反應(yīng)條件見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 μg/mL Goldview），應(yīng)用Gel-pro31凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因和內(nèi)參照基因PCR產(chǎn)物條帶累積光密度之比作為目的基因的相對(duì)mRNA水平。

表1　大鼠NF-κB、TGFβ1、FN及RPS16引物設(shè)計(jì)

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，計(jì)量資料組間兩兩比較采用單因素方差分析LSD法，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)，取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1血糖、血脂、血胰島素、ALT、AST水平 2型糖尿病組大鼠血糖（P＜0.01）、血甘油三酯（P＜0.01）、血膽固醇水平（P＜0.05）、血胰島素（P＜0.01）、血ALT（P＜0.01）、血AST（P＜0.01）明顯高于正常對(duì)照組；經(jīng)EGB治療后，大鼠血糖（P＜0.01）、血甘油三酯（P＜0.01）、血膽固醇（P＜0.05）、血胰島素（P＜0.01）、血ALT（P＜0.01）、血AST（P＜0.05）明顯低于2型糖尿病組（見表2）。

表2　3組大鼠血糖、血脂、血胰島素、ALT、AST水平比較（n=10，±s）

表2　3組大鼠血糖、血脂、血胰島素、ALT、AST水平比較（n=10，±s）

與2型糖尿病組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　血糖（mmol/L）　甘油三酯（mmol/L）膽固醇（mmol/L）　胰島素（mU/L）　ALT（U/L）　AST（U/L）正常對(duì)照組　6.31±0.42b　1.02±0.10b　2.10±0.85a　15.96±1.76b　33.3±15.85b　108.3±25.59b2型糖尿病組　27.48±1.94b　2.31±0.37b　10.15±3.39b　23.86±0.37b　177.3±66.12b　266.1±56.07bEGB治療組　16.39±0.42b　0.83±0.24b　6.91±1.56a　16.59±1.35b　93.2±26.56b　220.5±44.70a

2.2肝臟病理變化

2.2.1肝組織HE染色形態(tài)學(xué)改變：正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞正方形或多邊形，核居中，胞漿豐富紅染，肝索圍繞中央靜脈放射狀排列形成肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞未見明顯脂肪變性、氣球樣變及炎癥細(xì)胞浸潤，評(píng)分為0分；2型糖尿病組大鼠肝細(xì)胞明顯脂肪變性、氣球樣變性致肝細(xì)胞體積增大后肝索排列擁擠、肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞見多灶點(diǎn)狀壞死，小葉內(nèi)及匯管區(qū)見混合性炎癥細(xì)胞浸潤，NAS評(píng)分為（2.27± 0.78）分；EGB治療組肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變性、壞死以及小葉內(nèi)、匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤均有明顯減輕，NAS評(píng)分為（1.73±0.64）分，與2型糖尿病組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見圖1）。

2.2.2肝纖維化病變：VG染色顯示正常對(duì)照組大鼠僅在肝小葉中央靜脈、匯管區(qū)動(dòng)靜脈壁有少量紅染的膠原纖維，無明顯肝纖維增生現(xiàn)象，纖維化評(píng)分為0分；糖尿病大鼠肝小葉3區(qū)的竇周隙以及嚴(yán)重脂肪變性的肝細(xì)胞外、氣球樣變的肝細(xì)胞外出現(xiàn)“雞爪樣”膠原纖維增生，嚴(yán)重者小葉3區(qū)增生膠原纖維與匯管區(qū)增生膠原纖維相互連接，形成橋接纖維化，甚至匯管區(qū)增生的膠原纖維伸入小葉內(nèi)分割正常肝小葉形成假小葉結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)早期肝硬化改變，評(píng)分為（1.7±1.5）分，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（u=15，P＜0.01），EGB治療組顯示膠原纖維組織增生程度明顯減輕，評(píng)分為（0.40±0.70）分，低于2型糖尿病組（u=24，P＜0.05）（見圖2）。

圖1　各組大鼠肝組織病理變化（HE，×400）

圖2　各組大鼠肝組織纖維化病變（VG染色，×100）

2.3肝臟α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 生理情況下，α-SMA在肝組織內(nèi)僅在中央靜脈管壁、小葉間靜脈管壁及小葉間動(dòng)脈管壁的平滑肌細(xì)胞上表達(dá)。激活的肝星形細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）也呈α-SMA陽性表達(dá)［6］。正常對(duì)照組大鼠肝臟除了中央靜脈管壁、小葉間靜脈管壁及小葉間動(dòng)脈管壁的平滑肌細(xì)胞呈陽性表達(dá)外，未見HSC表達(dá)；2型糖尿病組大鼠大多數(shù)肝組織內(nèi)可見α-SMA陽性表達(dá)的局灶活化增生的HSC，有少數(shù)增生較彌漫，高倍鏡下活化的HSC胞漿突起呈星形或棱形，胞漿內(nèi)脂滴減小，其分布方式與VG染色顯示的增生的膠原纖維分布方式基本一致，評(píng)分為（1.60±1.35）分；EGB治療組大鼠活化的HSC數(shù)量明顯減少，部分大鼠肝臟未見活化的HSC，評(píng)分為（0.40±0.70）分，低于2型糖尿病組（P＜0.05）（見圖3）。

圖3　各組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)（Invision法，×400）

2.4肝臟組織NF-κB P65、FN蛋白的表達(dá) 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞NF-κB P65呈弱陽性表達(dá)，定位于胞漿，竇周隙也可見少量表達(dá)，糖尿病大鼠肝細(xì)胞NF-κB P65表達(dá)明顯增強(qiáng)，以中央靜脈周圍的肝細(xì)胞胞漿為著，部分肝細(xì)胞核亦見表達(dá)，其表達(dá)量與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞TGFβ1表達(dá)非常微弱，糖尿病大鼠在中央靜脈和匯管區(qū)周圍的肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較強(qiáng)表達(dá)，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；FN表達(dá)于肝細(xì)胞外間質(zhì)，正常對(duì)照組大鼠呈弱陽性表達(dá)，2型糖尿病組大鼠表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。EGB治療后，肝臟組織NF-κB P65、TGFβ1、FN表達(dá)均明顯減弱，與2型糖尿病組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），核表達(dá)NF-κB的肝細(xì)胞數(shù)量也明顯減少（見表3，圖4-6）。

2.5肝臟組織NF-κB、TGFβ1、NF-B基因mRNA表達(dá)正常對(duì)照組、2型糖尿病組、EGB治療組3組大鼠肝臟組織NF-κB基因mRNA表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）；2型糖尿病組TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05），經(jīng)EGB治療后，肝組織TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)水平較2型糖尿病組明顯降低（均P＜0.05）（見表4，圖7）。

表3　肝臟組織TGFβ1、NF-κB、FN蛋白表達(dá)結(jié)果比較（n=10，±s）

表3　肝臟組織TGFβ1、NF-κB、FN蛋白表達(dá)結(jié)果比較（n=10，±s）

與2型糖尿病組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　NF-κB　TGFβ1　FN正常對(duì)照組　4 206.86±1 430.56a　4 036.85±1 051.12b　5 701.9500± 9 461.75a2型糖尿病組　10 978.77±8 782.59　8 551.00±4 768.68　16 980.3000±11 529.29 EGB治療組　5 871.87±3 446.22a　5 585.55±2 288.14a　6 660.4534± 2 351.98a

圖4　各組大鼠肝組織NF-κB P65蛋白的表達(dá)（Invision法，×100）

圖5　各組大鼠肝組織TGFβ1蛋白的表達(dá)（Invision法，×400）

圖6　各組大鼠肝組織FN蛋白的表達(dá)（Invision法，×200）

表4　肝臟組織NF-κB、TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)結(jié)果比較（n=10，±s）

表4　肝臟組織NF-κB、TGFβ1、FN基因mRNA表達(dá)結(jié)果比較（n=10，±s）

與2型糖尿病組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別　NF-κB mRNA　TGFβ1 mRNA　FN mRNA正常對(duì)照組　0.88±0.31　0.4700±0.20b　1.22±0.39a2型糖尿病組　0.86±0.26　0.9100±0.19a　1.85±0.70aEGB治療組　0.89±0.35　0.6463±0.29a　1.23±0.31a

3　討論

研究表明，2型糖尿病是NAFLD發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7］。NAFLD主要組織學(xué)病變特點(diǎn)有肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、肝細(xì)胞溶解性壞死伴炎細(xì)胞浸潤及肝纖維化［1］。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前，較為公認(rèn)的致病因素是胰島素抵抗。最近的研究表明，NF-κB信號(hào)途徑（包括IKK激酶復(fù)合物、IκB和NF-κB）在胰島素抵抗發(fā)生的分子機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。在靜息狀態(tài)下IKKS是處于無活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到病原微生物、應(yīng)激作用、細(xì)胞因子、氧自由基等刺激時(shí)，IKKS活化。活化的IKKS使IκB氨基末端2個(gè)保守的Ser位點(diǎn)磷酸化［8］，并降解［9］。IκB的降解導(dǎo)致NF-κB從P50/P65/IκB異源性三聚體中游離而活化，通過核孔復(fù)合物轉(zhuǎn)位入核，與特定的NF-κB序列結(jié)合引起相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活［10］。NF-κB是炎癥啟動(dòng)和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵核因子，激活NF-κB可誘導(dǎo)TNF-α、白細(xì)胞介素、黏附分子等炎癥因子的表達(dá)［11］。TGFβ1是目前已知的最強(qiáng)的致肝纖維化細(xì)胞因子［12］，其活化因子組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的啟動(dòng)子中含有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB激活后轉(zhuǎn)位入核，通過與其NF-κB序列結(jié)合從而促進(jìn)TGFβ1表達(dá)［13］。HSC又名儲(chǔ)脂細(xì)胞，生理情況下HSC胞質(zhì)內(nèi)富含維生素A和甘油三酯，是人體內(nèi)儲(chǔ)存維生素A的主要場(chǎng)所?；罨腍SC不僅分裂增殖，而且轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，表達(dá)α-SMA，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)［6］。研究表明，HSC的活化需要細(xì)胞因子的作用，TGFβ1是HSC的主要生長因子。FN是肝臟生物基質(zhì)中一種主要成分，分布于肝臟所有的細(xì)胞外間隙中，包括血竇和基底膜，在肝內(nèi)主要由星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成，它是肝纖維化細(xì)胞外基質(zhì)中非膠原蛋白的主要成分。它還可以與細(xì)胞外基質(zhì)的其他成分如膠原、葡萄糖胺聚糖、纖維素結(jié)合以及與其他FN分子自聯(lián)，形成致密纖維網(wǎng)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積［14］。

圖7　各組大鼠肝組織NF-κB、TGFβ1、FN mRNA的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠表現(xiàn)高血糖、高血脂伴高胰島素血癥，血中肝功能指標(biāo)AST、ALT明顯升高，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性、氣球樣變性、壞死伴炎細(xì)胞浸潤，甚至小葉3區(qū)竇周隙周圍及嚴(yán)重脂肪變性的肝細(xì)胞外膠原纖維沉積等NAFLD病理特征［1］，說明高脂飲食加小劑量STZ復(fù)制的2型糖尿病大鼠并發(fā)NAFLD。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的HSC數(shù)量明顯增多，肝組織TGFβ1、FN mRNA的表達(dá)明顯升高，NF-κB P65、TGFβ1、FN的蛋白表達(dá)明顯升高，部分肝細(xì)胞因NF-κB活化后易位于核內(nèi)，呈核NF-κB P65表達(dá)。經(jīng)EGB治療后，糖尿病大鼠血糖、血脂下降，肝功能以及肝臟的病理改變明顯改善，α-SMA表達(dá)的HSC數(shù)量明顯減少，肝組織TGFβ1、FN mRNA的表達(dá)明顯降低，NF-κB P65、TGFβ1、FN的蛋白表達(dá)明顯下降，肝細(xì)胞核內(nèi)NF-κB P65表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱，提示EGB可能通過抑制NF-κB的活性，對(duì)多種致炎因子靶基因的激活作用減弱，使糖尿病大鼠胰島素抵抗及肝細(xì)胞的炎癥明顯減輕，從而改善肝組織的病理變化；另外，EGB通過抑制NF-κB的活性，對(duì)靶基因TGFβ1激活減弱，從而使TGFβ1活化HSC的能力減弱，肝合成細(xì)胞外基質(zhì)減少，從而減輕了NAFLD肝纖維化病變。EGB抑制NF-κB活性后，活化的HSC減少，因此，F(xiàn)N的mRNA和蛋白的表達(dá)減少，F(xiàn)N合成減少，也是肝纖維化病變減輕的主要原因之一。

綜上所述，EGB可減輕糖尿病大鼠NAFLD的病變，其機(jī)制可能與其抑制肝組織NF-κB P65、TGFβ1、FN的表達(dá)有關(guān)。

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（本文編輯：丁敏嬌）

The effect of EGB on expression of TGFβ1， NF-κB， and FN in hepatic tissues from diabetic rats with non-alcoholic fatty liver disease

WANG Jiayuan1， FAN Jianshuang1， WU Liang2， HUANG Kate2， WANG Rongrong2. 1.Pharmacy of Chinese Medicine， the Affi liated Wenzhou Chinese Medical Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Wenzhou， 325000； 2.Department of Pathology， the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Abstract：Objective： To observe the effect of extract of ginkgo biloba （EGB） on hepatic tissue from DM rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods： Thirty male Sprague-Dauley rats were divided randomly into three groups︰ normal control group， type 2 diabetic group and EGB-treated group. After being fed with high-fat feeding for 4 weeks， the later groups were injected with low dosage strepozotocin （30 mg/ kg） intraperitoneally to induce NAFLD model of type 2 diabetes mellitus. The EGB treated group was gavaged with EGB at the dosage of 50 mg·kg-1·d-1for 12 weeks. The pathologic changes of liver was observed under light microscopy （LM） stained with HE and VG staining respectively. Additionally， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN， α-SMA were assayed by immunohistochemistry （IHC）， the mRNA expression of TGFβ1，NF-κB， FN from rats livers were assayed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Liver specimen from diabetic rats stained by HE and VG showed obvious liver fatty degeneration， ballooning degeneration， dotty necrosis necrosis with accompanying infl ammatory infi ltration and fi brosis. Meanwhile， we discovered that there were a great number of α-SMA reactive hepatic stellate cells in diabetic rats liver tissue. In addition， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN （P＜0.05， P＜0.01， P＜0.05） and the TGFβ1， FN mRNA expression （P＜0.01， P＜0.05）of diabetic rats livers were significantly higher than that of the normal control group. After treatment withbook=4,ebook=38EGB， the pathological change of liver and proliferation of hepatic stellate cell in diatetic rats relieved （P＜0.05）. Meanwhile， the protein expression of NF-κB， TGFβ1， FN （P＜0.05） and the TGFβ1， FN mRNA expression （P＜0.05） of diabetic rats livers decreased signifi cantly compared with type 2 diabetic group. Conclusion： EGB can relieve NAFLD from diabetic rats. Down regulation of expression of NF-κB， TGFβ1， FN may be involved in it.

Key words：diabetes mellitus， type 2； non-alcoholic fatty liver disease； extract of ginkgo biloba； rats

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.008

收稿日期：2015-09-16

基金項(xiàng)目：溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120010）。

作者簡介：王家員（1976-），男，浙江溫州人，主管藥師。

通信作者：王蓉蓉，副主任醫(yī)師，Email：hulangwang307@163.com。