重組登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表達(dá)和免疫學(xué)特性研究

任守鳳，劉文權(quán)，曹國梅，梁韶暉，潘長旺

（溫州醫(yī)科大學(xué)　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，浙江　溫州　325035）

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重組登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII的融合表達(dá)和免疫學(xué)特性研究

任守鳳，劉文權(quán)，曹國梅，梁韶暉，潘長旺

（溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，浙江溫州325035）

［摘 要］目的：構(gòu)建含登革病毒（DENV）1-4型包膜蛋白（E蛋白）EDIII區(qū)的融合蛋白，并通過動物實(shí)驗(yàn)分析該融合蛋白的免疫機(jī)制。方法：通過生物信息學(xué)分析獲得具有廣泛代表性的DENV 1-4型EDIII區(qū)的氨基酸序列；將編碼DENV 1-4型EDIII區(qū)的基因序列通過GS linker進(jìn)行串聯(lián)后插入原核表達(dá)載體pColdIII的多克隆位點(diǎn)，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）；通過SDS-PAGE及Western blot法鑒定目的蛋白表達(dá)，采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。將純化的蛋白免疫BABL/c小鼠，初次免疫之后再加強(qiáng)免疫2次。通過ELISA法檢測血清中的抗體效價和細(xì)胞因子的分泌情況來評價其免疫效應(yīng)。結(jié)果：重組蛋白EDIII免疫小鼠后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，抗體效價為1︰40 000?？乖碳ば∈笃⒘馨图?xì)胞可以誘導(dǎo)Th1和Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答。結(jié)論：成功表達(dá)了含DENV 1-4型E蛋白EDIII的融合蛋白，并通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該融合蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為DENV四價重組疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］登革病毒；包膜蛋白；融合表達(dá)；四價疫苗

登革病毒（dengue virus，DENV）是一種單鏈正義RNA病毒，有4種血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）［1］，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊在人際間進(jìn)行傳播［2］。感染后主要引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征［3］。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界有超過36億人生活在登革熱流行區(qū)，每年感染DENV的人數(shù)超過5千萬，其中有近3萬人死亡［4］。近年來，我國沿海的臺灣、福建、廣東、廣西和云南均有登革熱的流行［5］。尤其是2014年，廣東省爆發(fā)了大規(guī)模的登革熱疫情，發(fā)病人數(shù)超過3萬例。因此，急需研制一種安全、有效的登革疫苗用于預(yù)防登革熱。

理想的登革疫苗應(yīng)該對DENV 1-4型均產(chǎn)生長遠(yuǎn)的保護(hù)。而篩選各血清型中具有廣泛代表性EDIII保守序列則是研制DENV 1-4型疫苗的前提。因此，本研究首先通過生物信息學(xué)分析獲得具有廣泛代表性的DENV 1-4型EDIII區(qū)的氨基酸序列；并將這些保守的DENV 1-4型EDIII區(qū)進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，為后續(xù)制備一種能同時針對DENV各血清型和絕大多數(shù)流行株的DENV四價重組亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株：原核表達(dá)載體pColdIII為本實(shí)驗(yàn)室保存。含DENV 1-4型EDIII抗原的重組質(zhì)粒puc57-EDIII由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。大腸桿菌DH5α和BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物：BABL/c小鼠（6～8周齡，雌性，清潔級）購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物合格證號：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.3主要儀器和試劑：限制性內(nèi)切酶XhoI、XbaI 和T4DNA連接酶等均購自Fermantas公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自Fermantas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；ECL發(fā)光劑購自北京天根生化科技有限公司；Ni-NTA螯合親和層析柱購自Qiagen公司。所用其他化學(xué)試劑均為分析純等級。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析：為選取具有廣泛代表性的DENV EDIII抗原，我們通過對黃病毒數(shù)據(jù)庫FLAVIdB （http︰//cvc.dfci.harvard.edu/flavi/）收錄的1 795條DENV1，1 487條DENV2，1 012條DENV3和407 條DENV4包膜蛋白（E蛋白）分別進(jìn)行氨基酸序列的比對分析，得到氨基酸保守性在90%以上的DENV 1-4型EDIII區(qū)序列作為候選靶抗原序列。

1.2.2重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII的構(gòu)建和鑒定：利用限制性內(nèi)切酶XhoI、XbaI對pColdIII質(zhì)粒和puc57-EDIII質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收并純化，T4DNA連接酶16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌中。氨芐青霉素平板篩選陽性克隆并用通用引物進(jìn)行PCR鑒定，篩選出其中的陽性克隆。將鑒定正確的對應(yīng)菌液進(jìn)一步送測序驗(yàn)證，測序工作由上海華大基因有限公司完成。

1.2.3重組蛋白EDIII的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定：挑選測序正確的陽性菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以1︰100的比例接種于10 mL LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，振蕩過夜；取1 mL新鮮培養(yǎng)的菌液，接種于20 mL LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37 ℃，250 r/min，振蕩培養(yǎng)2 h，在菌液A600為0.6時，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，15 ℃誘導(dǎo)22 h。以不加誘導(dǎo)劑的菌液作對照組。誘導(dǎo)結(jié)束后收集菌體，12 000 r/min，離心10 min；用磷酸鹽緩沖液（PBS）將菌體重懸，與上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱10 min，進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測蛋白誘導(dǎo)表達(dá)是否成功。將菌體用PBS重懸超聲裂解，然后將超聲后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳并用鼠抗His-tag抗體為一抗，對應(yīng)的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，進(jìn)行Western blot法分析鑒定檢測蛋白表達(dá)是在上清還是沉淀。結(jié)果顯示沉淀蛋白表達(dá)量比上清高。

1.2.4Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白：將EDIII重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過超聲破碎后收集上清和沉淀，將沉淀用8 mmol/L尿素裂解后收集上清，將收集的上清通過Ni-NTA螯合親和層析柱純化，以不同濃度的咪唑洗脫，將各濃度咪唑的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot法鑒定。對含有純化蛋白的洗脫液進(jìn)行透析、濃縮，測定蛋白濃度后于-20 ℃保存?zhèn)溆茫?-7］。

1.2.5免疫小鼠：將BALB/c小鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組以重組蛋白EDIII 50 μg稀釋于PBS，然后與等量弗氏完全佐劑混合至完全乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠（每只200 μL），對照組以PBS免疫小鼠，免疫的途徑、方法與實(shí)驗(yàn)組相同。于初次免疫后間隔2周再加強(qiáng)免疫2次。并于每次免疫后斷尾取血用于抗體效價的檢測。末次免疫后的第6周對BALB/c鼠進(jìn)行眼眶采血，分離血清，并取小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子檢測。

1.2.6免疫血清中抗體的檢測：用純化的EDIII蛋白包被ELISA板，用倍比稀釋的小鼠血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，TMB顯色液進(jìn)行顯色，抗體效價通過酶標(biāo)儀測定的450 nm波長的OD值獲得，抗體效價通過一抗的稀釋比表示。

1.2.7 細(xì)胞因子檢測：①脾淋巴細(xì)胞懸液的制備：將2組小鼠眼眶取血后頸椎脫臼處死，無菌條件下剖開小鼠腹腔取脾，將脾臟放入1 mL RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中清洗，將清洗過的脾臟置于400目濾網(wǎng)上，用5 mL注射器內(nèi)芯輕輕研磨，不斷向組織上滴加RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，直至組織內(nèi)絕大部分細(xì)胞被分離，將細(xì)胞懸液小心加于含有淋巴細(xì)胞分離液的15 mL離心管中，細(xì)胞懸液要加于淋巴細(xì)胞分離液的液面之上，18～22 ℃，400×g離心20 min。離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含淋巴細(xì)胞的細(xì)胞層）0.5 cm以上的上清液部分并棄去。吸取分離液層及淋巴細(xì)胞層置于另一新離心管內(nèi)。然后加10 mL PBS緩沖液混勻，250×g離心10 min，棄上清，用吸管以5 mL PBS緩沖液重懸所得細(xì)胞，250×g離心10 min后棄上清，加1 mL含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)，將脾細(xì)胞濃度用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整到1×107/mL。②細(xì)胞因子的檢測：將脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋到1×106/mL加到96孔板（每孔100 μL），然后加入DENV四價重組蛋白EDIII（5 μg/mL）抗原刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，用刀豆素（ConA 5 μg/mL）做陽性對照，培養(yǎng)細(xì)胞用的培養(yǎng)液（Media：RPMI 1640 media）做陰性對照，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清，-80 ℃保存?zhèn)溆茫瑴y定細(xì)胞因子的濃度。

2　結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析 對黃病毒數(shù)據(jù)庫FLAVIdB收錄的1 795條DENV1，1 487條DENV2，1 012條DENV3 和407條DENV4 E蛋白分別進(jìn)行氨基酸序列的比對分析，得到氨基酸保守性在90%以上的DENV1-4型EDIII區(qū)序列作為候選靶抗原序列，見圖1。

圖1　DENV1-4型EDIII區(qū)氨基酸序列的保守性分析

2.2重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII的構(gòu)建和鑒定 重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII的構(gòu)建示意圖（見圖2A）?？召|(zhì)粒pColdIII和重組質(zhì)粒puc57-EDIII經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XhoI、XbaI雙酶切之后，將目的基因EDIII用T4DNA連接酶連接到原核表達(dá)載體pColdIII獲得重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII。重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切鑒定，切出目的片段的大小是1 500 bp，與預(yù)期的大小一致（見圖2B）。測序結(jié)果顯示目的基因以正確的方向連接于載體，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2　重組質(zhì)粒pColdIII-EDIII的構(gòu)建和鑒定圖

2.3重組蛋白EDIII的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定 構(gòu)建好的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)后收菌，經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot分析鑒定檢測蛋白表達(dá)，其中Western blot檢測的一抗是鼠抗His-tag抗體（見圖3A-B）。將重組蛋白EDIII大量誘導(dǎo)表達(dá)并超聲破碎后分別經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot分析，結(jié)果顯示目的蛋白在在沉淀中含量較高，并且易于純化，將超聲后沉淀處理后，用不同濃度的咪唑溶液洗脫，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白主要存在于100 mmol/L咪唑洗脫液中（見圖3C），純化后純度達(dá)90%以上。

圖3　重組蛋白EDIII的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定和純化

2.4抗體水平檢測及動態(tài)觀察 不同時間對注射重組蛋白EDIII的8只小鼠斷尾取血，分離血清，用間接ELISA法檢測抗體IgG產(chǎn)生水平，免疫前血清作對照。結(jié)果顯示注射了重組蛋白EDIII的小鼠抗體效價隨時間延長而不斷升高，第3次免疫后達(dá)高峰并能維持一段時間，抗體效價為1︰40 000（見圖4）。

圖4　ELISA法檢測抗DENV1-4 EDIII抗體水平圖

2.5細(xì)胞因子檢測 實(shí)驗(yàn)組和對照組的脾淋巴細(xì)胞在不同刺激物作用下培養(yǎng)48 h后收集上清，測定細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組能誘導(dǎo)較高水平的IFN-γ、IL-4和IL-10，分別為40 pg/mL、8 pg/mL和186 pg/mL（見圖5），說明重組蛋白EDIII可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3　討論

DENV感染引起的登革熱是熱帶和亞熱帶國家和地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題。近年來，隨著全球氣候的變暖以及全球化帶來的人口流動性增加，DENV的暴發(fā)和流行變得更為頻繁，給人們的身體健康帶來了嚴(yán)重的威脅［8］。登革熱是由4種基因型相似但抗原性截然不同的血清型DENV引起的，所以理想的DENV疫苗必須能夠有效地對抗4種血清型DENV的感染［9］。

圖5　ELISA檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答

E蛋白是DENV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，E蛋白能和宿主細(xì)胞表面受體相互作用并在病毒入侵過程中起至關(guān)重要的作用，還能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體［10-11］。E蛋白有3個結(jié)構(gòu)域（DI、DII、DIII），其中DIII結(jié)構(gòu)域含有多個血清型特異的中和表位和宿主細(xì)胞受體識別位點(diǎn)，能誘導(dǎo)病毒型特異的保護(hù)性中和抗體和血凝抑制抗體的產(chǎn)生［12］。因此，DENV EDIII被廣泛認(rèn)為是候選疫苗的良好抗原。Fahimi等［13］從基因庫中篩選出3型DENV不同分離株的EDIII的氨基酸序列，經(jīng)過序列比對，篩選出序列一致的氨基酸序列作為靶序列并進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，將原核表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠后獲得特異性的抗EDIII蛋白抗體。同時，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IFN-γ 和IL-4）的濃度與對照組相比顯著增加。結(jié)果表明，表達(dá)的重組EDIII蛋白是免疫原性抗原，可以誘導(dǎo)針對3型DENV的特異性免疫反應(yīng)。但是DENV有4種血清型，單一型的重組蛋白不能對其他型的DENV產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。

目前制備DENV四價疫苗有兩種方式，一種是分別制備多個血清型的DENV抗原，并進(jìn)行混合配伍。如Zhao等［14］研究了一種基于EDIII的四價疫苗，將DENV的2個血清型（血清型1和2；血清型3和4）的EDIII區(qū)用甘氨酸-絲氨酸接頭（Gly4Ser3）連接串聯(lián)起來在大腸桿菌中分別表達(dá)。然后，這2個二價重組EDIII蛋白等量混合形成四價疫苗候選物MixBiEDIII?；旌弦呙绲娜秉c(diǎn)在于其疫苗組分需進(jìn)行獨(dú)立制備，且混合的劑量不容易進(jìn)行質(zhì)控，增加了其在實(shí)際應(yīng)用上的難度。目前，普遍采用一種將四價抗原進(jìn)行串聯(lián)的方法來制備DENV四價疫苗。如Poggianella等［15］設(shè)計了一種針對所有4種病毒血清型具有高中和抗體滴度的DNA疫苗，其免疫原性分子是將DENV EDIII融合于IgG的免疫球蛋白H鏈的二聚CH3結(jié)構(gòu)域，并將EDIII序列的密碼子優(yōu)化，密碼子優(yōu)化后的融合蛋白可以高水平表達(dá)，從而誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體應(yīng)答，免疫小鼠產(chǎn)生的血清對每種血清型感染性病毒顆粒產(chǎn)生反應(yīng)，具有低交叉反應(yīng)性和交叉中和活性。

但是重組的EDIII抗原存在免疫原性差異，不能有效誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用。而脂質(zhì)體蛋白Lipo被認(rèn)為是一種能夠有效提升免疫原性的佐劑，已被廣泛應(yīng)用在腫瘤和病毒疫苗的制備上。如Song等［16］將脂蛋白脂-D1E3（脂-NTER）的胰蛋白酶N-末端片段與重組突變HPV16 E7（rE7m）的蛋白質(zhì)混合免疫小鼠，能提升抗E7的抗體滴度并抑制腫瘤生長。Chen等［17］選擇了4型DENV EDIII作為登革熱疫苗候選抗原，并在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)脂化形式的重組蛋白。在沒有外源佐劑的情況下，重組脂化4型DENV EDIII誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體的頻率比非脂化形式的高。重要的是，重組脂化4型DENV EDIII免疫的小鼠表現(xiàn)出持久的中和抗體反應(yīng)，并在攻擊后減少了病毒血癥的水平。因此，我們認(rèn)為脂化策略可以應(yīng)用到DENV的四價串聯(lián)疫苗的制備。

本研究通過生物信息學(xué)分析獲得1-4型DENV EDIII的保守氨基酸序列，并將4種血清型DENV EDIII區(qū)的基因序列用連接肽鏈接起來，從而實(shí)現(xiàn)一個重組蛋白可以對4種血清型DENV產(chǎn)生免疫保護(hù)的目標(biāo)［18-21］。除此之外，本研究采用冷休克表達(dá)載體pColdIII，cspA為啟動子，當(dāng)溫度降到至15 ℃時，大腸桿菌生長緩慢，菌體蛋白表達(dá)減少，從而提高了目的蛋白的表達(dá)效率。選擇BL21感受態(tài)細(xì)胞也有利于目的蛋白的表達(dá)，最終獲得大量原核表達(dá)的重組蛋白，然后超聲破碎，將沉淀處理后進(jìn)行蛋白純化，純化后蛋白純度可達(dá)90%以上。由于誘導(dǎo)后沉淀的蛋白濃度比上清濃度高，而且我們也嘗試著用上清做純化，但是純化后蛋白純度不高，為了獲得高純度高濃度的重組蛋白，我們選擇沉淀進(jìn)行純化，并將獲得的重組蛋白進(jìn)行動物免疫試驗(yàn)。動物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示我們構(gòu)建的單一四價重組蛋白EDIII可以誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，抗體效價可以達(dá)到1︰40 000。我們還通過檢測細(xì)胞因子水平檢測了細(xì)胞免疫應(yīng)答水平［22-23］。單一四價重組蛋白EDIII可以誘導(dǎo)高水平的IFN-γ和IL-10。在疫苗研究中，細(xì)胞因子檢測的重要性在于細(xì)胞因子可以激活抗原提呈細(xì)胞使宿主處于抗病毒狀態(tài)，而且在病毒感染過程中細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［24-25］。

總之，本研究通過對免疫小鼠特異性抗體檢測，細(xì)胞因子檢測證明我們構(gòu)建的單一四價重組蛋白可以誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為后續(xù)制備新型單一四價重組亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

Fusion expression and immune investigation of recombinant dengue virus EDIII tetravalent protein

REN Shoufeng， LIU Wenquan， CAO Guomei， LIANG Shaohui， PAN Changwang. Department of Parasitology， School of Basic Medical Science， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Abstract：Objective： To construct dengue virus envelope protein EDIII tetravalent recombinant vaccines and to analyze its immunogenicity. Methods： Firstly， the gene sequences encoding dengue virus type 1-4 envelope protein EDIII were analyzed by bioinformatics methods， and the representative DENV1-4 EDIII was selected and connected by GS linker to obtain chimeric EDIII； Then， the chimeric gene coding EDIII was inserted into the multiple cloning site of the expression vector pColdIII to constructe the recombinant vector pColdIII-EDIII. The constructed pColdIII-EDIII plasmid was transformed into E.coli BL21 cells and induced by IPTG. The recombinant protein EDIII was purifi ed by Ni-NTA affi nity chromatography and confi rmed by SDS-PAGE and Western blot analysis. The purifi ed protein was used to immune BABL/c mice. After boosting twice， to detect the antibody titers in serum and the secretion of cytokines by ELISA to evaluate the immune response. Results： The mice immunized with EDIII could induce specifi c antibodies and the antibody titers was 1︰40 000. The mouse spleen lymphocytes stimulated by antigen could produce cytokine including IFN-r， IL-4， IL-10， which were signifi cantly higher in the experimental group. Conclusion： Our studies indicates that dengue virus envelope protein EDIII tetravalent vaccine can induce specifi c humoral and cellular immune response， and give priority to with the humoral immune response， which laid the foundation for the research of a new type of chimeric tetravalent vaccine in the future.

Key words：dengue virus； envelope protein； fusion expression； tetravalent vaccine

［中圖分類號］R373.33

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.001

收稿日期：2015-12-23

基金項目：浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY13C080001）。

作者簡介：任守鳳（1989-），女，山東沂源人，碩士生。

通信作者：潘長旺，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wzpcw@sohu. com。