藏藥EH復方降糖顆粒處方篩選及產品穩(wěn)定性研究

李 艷，毛 羽，楊邦祝，沈睿娟，杜朗宇，林靈敏，雷 敏，謝雨蕉(.西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 6004；.爐霍雪域俄色責任有限公司，四川 甘孜州 66500； .爐霍縣林業(yè)局，四川 甘孜州 66500)

藏藥EH復方降糖顆粒處方篩選及產品穩(wěn)定性研究

李 艷1，毛 羽1，楊邦祝1，沈睿娟1，杜朗宇1，林靈敏1，雷 敏2，謝雨蕉3
(1.西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 610041；2.爐霍雪域俄色責任有限公司，四川 甘孜州 626500； 3.爐霍縣林業(yè)局，四川 甘孜州 626500)

摘 要：目的：結合中、藏醫(yī)藥理論將藏藥材ES與黃芪、麥冬、枸杞子、山藥等中藥進行組方配伍，運用降糖活性評價篩選其制劑處方，并確立藏藥EH復方降糖顆粒制劑的最佳成型工藝，并考察其穩(wěn)定性.方法：考察了水提液、醇提液對腎上腺素模型組小鼠血糖的影響，以吸濕性、溶解度、成型率為指標，篩選出處方中加入輔料的品種、配比及最佳成型工藝，以高溫、高濕、強光照射及加速試驗對顆粒劑進行穩(wěn)定性考察.結果：藏藥EH復方水提液及醇提液對腎上腺素所致的小鼠高血糖具有明顯的降糖作用，以水提液高劑量組為佳；同時，最佳制粒成型工藝：將藥液濃縮至相對密度1.28～1.30(60℃)的稠膏，加入1.3倍的可溶性淀粉-糊精(1：1)，混合，制軟材，用10目篩擠壓制粒，升溫到40℃下先干燥30 min，然后升溫到50℃，保持2 h，取出后過一號篩和四號篩整粒，密封即得.該制劑在60℃、相對濕度75%、照度4000Lx的條件下，顆粒劑中黃芪甲苷的含量受溫度、濕度及光照的影響較大，采用密封性及遮光性較好的鋁塑復合袋包裝后，加速穩(wěn)定性試驗表明成品質量基本穩(wěn)定.結論：藏藥材ES與中藥組方制備成顆粒制處方合理，成型制備工藝可行，對腎上腺素致小鼠高血糖具有明顯的抑制作用，且顆粒劑穩(wěn)定性良好.

關鍵詞：俄色；EH降糖顆粒；成型工藝；2型糖尿病

藏藥“俄色”為薔薇科蘋果屬植物，是生長在海拔3000至3800米青藏高原東南緣的薔薇科蘋果屬食藥兩用植物，前期研究表明，“俄色”總黃酮具有降血糖、降血脂等作用，并系統進行了以“俄色”為主要原料的食品、保健食品、藥品等相關研究開發(fā)工作[1-2].藏藥EH復方降糖顆粒是在藏區(qū)民間驗方的基礎上，結合中、藏醫(yī)藥理論，與黃芪[3]、麥冬[4]、枸杞子[5]、山藥[6]等中藥組方制得的降血糖復方制劑，具有生津止渴、健脾補腎、益氣養(yǎng)陰的功效.主要用于治療氣陰兩虛型消渴病及2型糖尿病的治療[7].本研究根據處方的功能主治和處方藥材有效成分的理化性質，結合藥效實驗研究，以及用藥及提取物的性質和劑型要求，選擇合適的輔料制作顆粒，對顆粒的性狀、吸濕率、成型率等方面進行考察，系統考察EH顆粒劑的成型工藝研究[8-9]及穩(wěn)定性.

1　儀器與試藥

1.1 儀器

FD-1冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);怡成JPS-5型手持式快速全血葡萄糖測試儀;怡成虹吸式血糖試條.

1.2 試藥

鹽酸腎上腺素注射液(重慶迪康長江制藥有限公司);消渴丸(廣州中一藥業(yè)有限公司);降糖寧膠囊(陜西華西制藥股份有限公司);ES(自采加工炮制)，黃芪、山藥、麥冬、枸杞子等均購買自四川海王星辰藥房有限公司;EH顆粒浸膏由本實驗室提取生產制備;糊精;可溶性淀粉;微晶纖維素;蒸餾水.

1.3 動物

KM種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，購買于四川省實驗動物專委會，合格證號:SCXK[川]2008-14.

2　方法與結果

2.1 EH復方有效浸出物的成方篩選研究

由藥物的現代研究可知，本處方中的主要有效成分有黃酮類、皂苷類、多糖類等，其中黃酮類和皂苷類均易溶于熱醇和熱水中，而多糖僅溶于熱水中，所以本文中溶媒只針對水和乙醇進行考察.根據處方的功能主治，選擇了降血糖藥效指標，確定用腎上腺素高血糖模型對各樣品作平行藥效試驗，進行實驗篩選.篩選出降血糖作用較好的樣品，即有效浸出物.

2.1.1 EH復方水提、醇提的藥效比較

2.1.1.1 樣品的制備

(1)水提液的制備

稱取處方量藥材飲片，加入8倍量水浸泡0.5 h后，提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液并濃縮至100 mL藥液含原藥材59 g，即相對濃度為59%.臨用前加蒸餾水分別配制成相對濃度為39%、19.5%的溶液.

(2)醇提液的制備

稱取處方量藥材飲片，加入8倍量90%乙醇浸泡0.5 h，回流2次，每次1 h，過濾，合并濾液回收乙醇后加水稀釋至100 ml藥液含原藥材59 g，即相對濃度為59%.臨用前加蒸餾水分別配制成相對濃度為39%、19.5%的溶液.

2.1.1.2 篩選方法及結果

取100只KM小鼠，按體重分層隨機分為10組.正常組和模型組給予等體積(0.6 ml)蒸餾水灌胃.降糖寧組按0.72 g·kg-1灌胃.消渴丸組按0.56 g·kg-1灌胃.復方水提液高劑量組給水提液(59%)按17.56 g·kg-1灌胃;中劑量組給水提液(39%)按11.7 g· kg-1灌胃;低劑量組給水提液(19.5%)按5.86 g·kg-1灌胃.復方醇提液高劑量組給醇提混懸液(59%)按17.56 g·kg-1灌胃;中劑量組給醇提混懸液(39%)按11.7 g·kg-1灌胃;低劑量組給醇提混懸液(19.5%) 按5.86 g·kg-1灌胃.各組動物每天灌胃1次，連續(xù)7天.于末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥1 h后除正常組外其余各組按0.15 mg·kg-1腹腔注射鹽酸腎上腺素.篩選結果如下(見表1).

表1　處方不同部位對腎上腺素致高血糖小鼠的影響Table 1 Adrenaline cause hyperglycemia mice at different positions of the prescription

由表1結果可知，與空白組比較，模型組的血糖明顯升高，表明糖尿病動物模型復制成功.與模型組比較，EH復方無論水提組還是醇提物均能明顯降低小鼠血糖值(均P＜0.01)，尤以水提物的降糖效果最優(yōu)，同時考慮到提取成本，提取采用水提法.

2.1.2 EH復方水體液分提、合提的考察

2.1.2.1 樣品的制備

(1)ES水提液的制備

按處方中ES用藥量，稱取一倍ES藥材，加入8倍量水浸泡0.5 h后，提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液并定容至100 ml藥液含ES原藥材4.5 g(與水提高劑量組中所含ES量一致)，即相對濃度為4.5%.

(2)四藥水提液(去ES)的制備

按處方比例稱取除ES以外的其他四味藥材，加入8倍量水浸泡0.5 h后，提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液并定容至100 ml藥液含原藥材54 g(與水提高劑量組中所含ES量一致)，即相對濃度為54%.

(3)混合液的制備

按上述兩種方法制備出兩種水提液，將水提液合并，再濃縮至100 ml藥液含原藥材59 g，即相對濃度為59%.

2.1.2.2 篩選方法及結果

取上述三個樣品溶液，依照2.1.1.2項下方法做小鼠血糖試驗，結果見表2.

表2　單提、合提對腎上腺素致高血糖小鼠的影響Table 2 Single extraction，extraction of adrenaline to the influence of hyperglycemia mice

由表2結果可知，混合液降血糖作用較好，且與全方合提作用相近，為了方便提取操作以及節(jié)約能耗，故本論文選擇處方藥材合提.

2.2 劑型選擇

糖尿病屬于慢性病，需要長期用藥，傳統中藏藥復方制劑多以湯劑為主，服用不便，不宜工業(yè)化生產，而顆粒劑與湯劑相比，既保持了湯劑作用迅速的特點，又克服了以上缺點，適合于大規(guī)模生產.前期實驗表明，水提液療效最佳，而水提液的出膏率較大，約為35%，如做成片劑、膠囊劑等，每次所需服用量大，若制成顆粒劑，不僅能保留湯劑原有的成分和療效，而且能滿足服用劑量的要求，服用方便.故本課題選用可溶性顆粒劑作為該處方的研制劑型.

結合提取物的性質和劑型要求，選擇合適的輔料制作顆粒，并以顆粒的性狀、吸濕率、成型率等方面為指標，來篩選出顆粒劑最佳的成型工藝條件.

2.3 浸膏相對密度的選擇

由本實驗室按處方加水合提[10]，濃縮制備浸膏，分別取相對密度為1.23～1.25(60℃)、1.28～1.30 (60℃)、1.32～1.35(60℃)的稠膏加入適量可溶性淀粉，均可制出合格顆粒，但當稠膏密度為1.32～1.35(60℃)時，其流動性差，不利于后期稱量制粒，而密度為1.23～1.25(60℃)時，單服劑量顆粒劑中有效成分含量較低，服藥劑量較大，所以，選擇相對密度為1.28～1.30(60℃)的稠膏進行制粒.

2.4 輔料的選擇

2.4.1 不同輔料對制粒的影響

稱取適量稠膏三份，分別加入干燥過的可溶性淀粉、糊精、可溶性淀粉-糊精(1:1)、可溶性淀粉-糊精(1:3)、可溶性淀粉-糊精(1:5)各13 g，混合均勻，在不添加乙醇的情況下制粒，考察軟材情況、過篩難易以及顆粒的外觀等，結果見表3.

表3　輔料對制粒的影響Table 3 The impact on the granulating of accessories

由上表可知:當可溶性淀粉-糊精為(3:1)、(1:1)時，制粒情況較好，顆粒色澤深，粒度均勻.

2.4.2 不同輔料對顆粒吸濕率及溶化性考察

取底部盛有NaCl過飽和溶液的玻璃干燥器，干燥器內置一稱量瓶，放入25℃恒溫干燥箱內恒溫48h，此時干燥器內的相對濕度為75%.在已干燥至恒重的稱量瓶底部放入厚約2 mm所需測定的顆粒，精密稱定后置于上述干燥器中，打開稱量瓶蓋，于4，8，12，24，48 h精確稱量瓶與顆粒的重量[11]，計算吸濕百分率.試驗結果見表4.

表4　吸濕百分率測定結果Table 4 Moisture absorption percentage determination results

根據上表做不同輔料的時間-吸濕率曲線圖，見圖1.

圖1　不同輔料吸濕曲線圖Fig.1 Different moisture absorption curve of accessories

由上圖表可知:輔料添加糊精、可溶性淀粉-糊精(1:1)、可溶性淀粉-糊精(3:1)、微晶纖維素時，顆粒的吸濕性都較低，但微晶纖維素制得的顆粒不符合溶化性要求，且有分層現象，結合對制粒情況的考察，最終選擇可溶性淀粉-糊精(1:1)作為顆粒劑的輔料.2.4.3 輔料用量的考察

稱取稠膏適量，共三份，分別加入1.2，1.3，1.4倍可溶性淀粉-糊精(1:1)，制粒，以顆粒的合格率、過篩情況為指標[12]，選擇最適合的輔料用量.結果見表5.

表5　不同輔料用量的考察結果Table 5 Different excipients dosage of inspection results

由表5結果可知，輔料用量為稠膏量的1.2、1.3、1.4倍時，制成的顆粒合格率都符合要求，結合制粒情況，最終選擇輔料用量為稠膏量的1.3倍.

2.5 制粒、干燥及整粒

將減壓濃縮所得的稠膏，加入1.3倍的可溶性淀粉-糊精(1:1)，充分攪拌均勻，制軟材，過10目篩制粒.干燥，將所制的顆粒放入烘箱中，升溫到40℃下先干燥30 min，然后升溫到50℃，保持2 h，即可.整粒，將干燥完全的顆粒過一號篩后，以四號篩去過細部分.

2.6 制劑工藝的確定

按處方比例準確稱取適量藥材，先加入1.5倍水浸0.5 h后，再加入10倍水提取3次，每次0.5 h，合并提取液，濾過除雜后，經減壓濃縮至密度為1.28～1.30(60℃)的稠膏，再加入可溶性淀粉-糊精(1:1)，制粒，干燥，整粒，得顆粒共計1000 g，每天服用3次，則每次服用15 g.

2.7 顆粒的質量檢查

為了保證顆粒成品質量的穩(wěn)定性和一致性，需對半成品的質量進行控制[13]，因此本文對顆粒的休止角、堆密度進行了測定，具體操作及結果如下.

2.7.1 休止角

取適量半成品顆粒，用固定漏斗法測定休止角α[14].測定方法:將2只漏斗串聯并固定于水平放置的坐標紙上高H處，小心地將顆粒沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中直到最下面漏斗形成的藥粉圓錐體尖端接觸到漏斗口為止，又坐標紙測出圓錐底部直徑2R，計算出休止角(tanα= H/ R)[15].結果見表6.

表6　顆粒休止角測定結果(n =3)Table 6 Particles repose Angle determination results(n =3)

由表6結果可知，該顆粒休止角小于40°，流動性較好.

2.7.2 堆密度

稱取一定量的顆粒，裝入25mL量筒中，按一定方式振動量筒數次，保證實驗條件一致，量得顆粒容積，以重量及容積計算堆密度，堆密度=顆粒質量(g) /容積(mL)[16]，結果見表7.

表7　顆粒堆密度測定結果(n =3)Table 7 Grain bulk density determination results(n =3)

由表7結果可知:由制劑處方可知，每次服用15g，其體積約為28mL，可制成一袋，即15g/袋.

2.8 穩(wěn)定性試驗

2.8.1 影響因素試驗

本文采用高濕、高溫、強光照射試驗，用以了解溫度、濕度、光照對EH降糖顆粒劑穩(wěn)定性的影響[13]，操作如下:取三批EH降糖顆粒劑，共9份，置稱量瓶中，攤成約3 mm厚薄層，進行質量穩(wěn)定性研究.

(1)高濕度試驗

將稱量瓶開口置相對濕度75%的干燥器中[17]，于第十天取樣，按穩(wěn)定性考察項目進行檢測，同時準確稱量試驗前后供試品的重量，以考察供試品的吸濕潮解性能.結果見表8.

(2)高溫試驗

將稱量瓶開口置恒溫干燥箱，60℃溫度下放置10天[18]，在第十天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進行檢測，再準確稱量試驗前后供試品的重量，來考察供試品風化失重的情況.結果見表8.

(3)強光照射試驗

將稱量瓶開口置強光穩(wěn)定試驗箱內，在4000Lx的照度條件下放置，第十天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進行考察，特別要注意供試品的外觀變化.結果見表8.

表8　穩(wěn)定性影響因素試驗Table 8 Stability influence factors experiment

由表8結果可知，經過三種強化實驗后，ESF(俄色總黃酮)含量沒有顯著變化，而黃芪甲苷在三種強化實驗條件下放置10天后，其含量均略有降低，說明本品中黃芪甲苷受溫度、濕度、光照影響較大.

(4)包裝材料的選擇

影響因素試驗中表明，顆粒劑中黃芪甲苷的含量受溫度、濕度及光照的影響較大，所以本品選用密封性及遮光性較好的鋁塑復合袋包裝.

2.8.2 加速試驗

將EH降糖顆粒劑三批樣品(批號:13091116、131119、131122)，置于溫度為40℃和相對濕度75%的條件下放置3個月[19].在試驗期間于0個月、1個月、2個月、3個月各取樣一次，進行試驗，考察項目為，性狀、粒度、水分、溶解性、鑒別、含量測定[20]，結果見表9、表10、表11.

表9　穩(wěn)定性考察Table 9 Stability test

表10　穩(wěn)定性考察Table 10 Stability test

表11　穩(wěn)定性考察Table 11 Stability test

批號:131122　　標準規(guī)定　0月　1月　2月　3月含量測定ESF　?。?0.00mg/袋　112.50　113.04　112.16　111.99黃芪甲苷　?。?.08mg/袋　1.32　1.32　1.30　1.28粒度　?。?5%　4.2%　4.0%　4.3%　4.5%水分　?。?.0%　1.7%　1.7%　1.8%　2.0%溶化性　　應全部溶化　　合格　　合格　　合格　　合格微生物限度細菌數(個/ g)　?。?000　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定霉菌數(個/ g)　?。?00　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定　　符合規(guī)定大腸桿菌　　不得檢出　　未檢出　　未檢出　　未檢出　　未檢出

由表9～11結果可知，通過上述加速穩(wěn)定性試驗表明，三批樣品在現有包裝條件下基本穩(wěn)定.

3　討論與結論

用腎上腺素高血糖模型對各樣品作平行藥效試驗，結果混合液降血糖作用較好，且與全方合提作用相近，為了方便提取操作以及節(jié)約能耗，故本論文選擇處方藥材合提以合提浸膏作為顆粒劑原料中間體.同時，通過對稠膏密度、輔料選擇及用量的篩選后，確定了制粒的工藝為:將藥液濃縮至相對密度1.28～1.30(60℃)的稠膏，加入1.3倍的可溶性淀粉-糊精(1:1)，混合，制軟材，用10目篩擠壓制粒，升溫到40℃下先干燥30 min，然后升溫到50℃，保持2 h，取出后過一號篩和四號篩整粒，密封即得.此外，曾試過用真空干燥、真空冷凍干燥法對提取物進行干燥，均不能干燥完全，所以本文選擇了濕法制粒.制粒過程中，使用可溶性淀粉為輔料時，干燥后顆粒易碎，因此需要使用粘合劑.而本制劑用于治療糖尿病，制劑應不含蔗糖，因此在濕法制粒過程中選擇了糊精作為粘合劑.最后，在對EH降糖顆粒的初步穩(wěn)定性研究實驗中，通過高溫、高濕度和強光照射三個影響因素試驗，表明顆粒劑中黃芪甲苷的含量受溫度、濕度及光照的影響較大，從而選擇了密封性及遮光性較好的鋁塑復合袋進行包裝.在確定了成品的包裝后，通過加速穩(wěn)定性試驗對成品進行了考察，表明成品在現有包裝條件下質量基本穩(wěn)定.

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(責任編輯：李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯：周序林，鄭玉才)

Prescription screening and product stability of Tibetan medicine EH compound hypoglycemic granule

LI Yan1，MAO Yu1，YANG Bang-zhu1，SHEN Rui-juan1，DU Lang-yu1，LIN Ling-min1，LEI Min2，XIE Yu-jiao3
(1.Ethnic Pharmaceutical Institute of Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.; 2.Luhuo Snow-world ESE CO.，LTD，Ganzi 626500，P.R.C.;3.Luhuo Forestry Administration，Ganzi 626500，P.R.C.)

Abstract:Objective:To establish Tibetan medicine EH hypoglycemic granule preparation of compound molding process，and investigate its stability.Tibetan medicine ES and Chinese medicine(Astragalus，Radix，Medlar，Yams)were composed，and the pharmaceutical formulations were screened by using of hypoglycemic activity evaluation.Methods:The effects of water extraction and alcohol extraction were examined on blood sugar of epinephrine model group mice.Based on hygroscopicity，solubility and forming rate，the preparation process，the variety and proportion of the excipients were screened out，and established the stability study method of the granule preparation by high temperature，high humidity，strong light irradiation and acceleration tests.Results:Tibetan EH compound water extract and alcohol extract for adrenaline-induced hyperglycemic mice had obvious hypoglycemic effect，water extract high-dose group was better;At the same time，the perfect granulating process was:thickening liquid to relative density 1.28 to 1.30(60℃)，adding 1.3 times soluble starch - dextrin(1:1)，mixing into soft material，using 10 mesh sieve extruded granulating，the temperature was raised to 40℃and dried for 30 min，then heated to 50℃，holding 2h，taking out after the fourth sieve and one sieve granulated，sealed.Under the conditions of 60℃，relative humidity of 75%，illumination 4000Lx，the astragaloside content in the pharmaceutical was greatly influenced by temperature，humidity and light.Packaged by sealing and shading aluminium plastic composite bag，the results of accelerated stability test showed that the product quality was stable.Conclusion:The ES Tibetan medicine and traditional Chinese medicine prescription prepared granules is reasonable，the molding process is feasible，it has obvious inhibitory effect on adrenaline-induced hyperglycemic mice，and the stability of granules is good.

Key words:ES;EH hypoglycemic granule;Molding process;Type 2 diabetes

中圖分類號：R28；R29

文獻標志碼：A

文章編號：2095-4271(2016)02-00162-08

doi:10.11920/ xnmdzk.2016.02.007

收稿日期：2015-12-02

通信作者：毛羽(1961 - )，漢族，四川人，副教授，博士，碩士生導師，研究方向:中藥及民族藥新藥新制劑研發(fā).E - mail:yumao192000@126.com

基金項目：四川省農業(yè)科技成果轉化資金項目“雪域俄色茶產業(yè)化生產示范”(14NZ0015)