阿侖膦酸鈉、辛伐他汀在糖尿病大鼠下頜骨骨折愈合過程中的作用

孟子煊，李金源，石　鷹

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阿侖膦酸鈉、辛伐他汀在糖尿病大鼠下頜骨骨折愈合過程中的作用

孟子煊，李金源，石鷹

[摘要]目的：通過觀察骨保護(hù)素(OPG)表達(dá)情況，探討阿侖膦酸鈉及辛伐他汀對(duì)1型糖尿病大鼠下頜骨骨折愈合過程作用差異。方法：選擇120只雄性Wistar大鼠隨機(jī)均分為5組：對(duì)照組、糖尿病組、胰島素治療組、胰島素+阿侖膦酸鈉治療組、胰島素+辛伐他汀治療組。除對(duì)照組外，其余4組成功建立糖尿病模型，5組大鼠手術(shù)建立單側(cè)下頜骨骨折模型，術(shù)后第2天開始藥物干預(yù)。于骨折后第2、4、6、8周檢測血清OPG含量。結(jié)果：應(yīng)用阿侖膦酸鈉、辛伐他汀組愈合情況均明顯較糖尿病組好，骨折后OPG表達(dá)水平也均明顯高于糖尿病組(P<0.01)。結(jié)論：阿侖膦酸鈉及辛伐他汀均可通過調(diào)節(jié)OPG含量促進(jìn)糖尿病骨折愈合，辛伐他汀的作用效果更顯著。

[關(guān)鍵詞]合頁骨折；糖尿??；骨保護(hù)素；阿侖膦酸鈉；辛伐他汀；大鼠

糖尿病是一種消耗性疾病，對(duì)骨骼的影響非常明顯。因高血糖會(huì)影響膠原形成，進(jìn)而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松、缺鈣、彈性減弱等情況。所以糖尿病患者骨質(zhì)相對(duì)脆弱，骨折愈合慢、不愈合率或延遲愈合率及假關(guān)節(jié)形成率高。二膦酸鹽是治療骨質(zhì)疏松常用藥物，持續(xù)服用能顯著增加骨量，提高骨質(zhì)強(qiáng)度，降低骨折發(fā)生率，有較好臨床療效[1]。其主要作用機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞的骨吸收。他汀類藥物是常用的降血脂藥物，近來研究發(fā)現(xiàn)該類藥物有增加骨密度和降低骨折風(fēng)險(xiǎn)的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察阿侖膦酸鈉、辛伐他汀對(duì)糖尿病大鼠骨折愈合過程的影響,探討兩藥的作用差異，以期為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑成年雄性Wistar大鼠120只，質(zhì)量250～300 g，SPF級(jí)[許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003]。試劑及儀器有：阿侖膦酸鈉，辛伐他汀，鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma 公司)，中效胰島素，齒科打磨機(jī)，手術(shù)器械等。

1.2動(dòng)物模型制作

1.2.1糖尿病模型大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=24)和實(shí)驗(yàn)組(n=96)，對(duì)照組記為A組。實(shí)驗(yàn)組大鼠于造模前一晚禁食不禁水12 h，(50 mg/kg)腹腔注射法對(duì)禁食后大鼠建立糖尿病模型。STZ注射72 h后測隨機(jī)血糖，>16.7 mmol/L者視為造模成功。造模前，保證隨機(jī)血糖處于正常水平(5.9～7.6 mmol/L)。

1.2.2骨折模型糖尿病模型建立后，全部大鼠通過手術(shù)建立單側(cè)下頜骨骨折模型。用10%水合氯醛3 mL/kg 行腹腔麻醉后，采用頜下切口暴露一側(cè)下頜骨體下緣及其頰舌側(cè)面，用慢速手機(jī)(1 500 r/s)于下頜骨體下緣咬肌嵴的遠(yuǎn)中末端處制作1 mm×3 mm的貫穿頰舌側(cè)的不完全骨折模型。

1.3造模術(shù)后的處理及觀察根據(jù)干預(yù)手段不同，再將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)平均分為B、C、D、E 4組。A組(對(duì)照組)：每天等容0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃；B組(糖尿病組)：每天等容0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃；C組(胰島素治療組)：每天3 IU胰島素頸背部皮下注射，并等容0.9%氯化鈉注射液灌胃；D組(胰島素+阿侖膦酸鈉治療組)：除每天3 IU胰島素外，另5 mg/kg阿侖膦酸鈉懸濁液灌胃；E組(胰島素+辛伐他汀治療組)：除每天3 IU胰島素注射外，另10 mg/kg辛伐他汀溶液灌胃。術(shù)后第2天即開始藥物干預(yù)，持續(xù)8周。

1.4標(biāo)本采集與免疫組織化學(xué)各組于術(shù)后第2、4、6、8周隨機(jī)處死6只大鼠，測定血清骨保護(hù)素(OPG)含量。同時(shí)取出下頜骨，截取骨折處0.5 cm×0.5 cm的組織塊，制作石蠟切片。按標(biāo)準(zhǔn)步驟行免疫組織化學(xué)染色。用Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)，測定OPG陽性染色區(qū)域的平均吸光度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠糖尿病成模率應(yīng)用STZ 50 mg/kg建立的糖尿病模型復(fù)制成功率為91.89%。

2.25組大鼠骨折愈合過程中血清OPG含量比較2周時(shí)A組血清OPG均明顯高于B、C、D和E組(P<0.01)，D組和E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4周時(shí)D組血清OPG明顯高于A、B、C和E組(P<0.01)；6周時(shí)D、E組血清OPG含量顯著高于B、C組(P<0.01)，D組和E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；8周時(shí)A、D、E 3組仍明顯高于B、C組(P<0.01)，但A組血清OPG含量顯著高于D組和E組(P<0.01)(見表1)。

2.3骨痂區(qū)OPG表達(dá)結(jié)果OPG主要表達(dá)在成骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表現(xiàn)。

表1　5組大鼠不同時(shí)間血清OPG含量比較(ni=6；

q檢驗(yàn)：與A組比較**P<0.01；與B組比較△P<0.05，△△P<0.01；與C組比較##P<0.01；與D組比較++P<0.01

骨折后A組與C、D、E組均較B組骨痂組織內(nèi)陽性表達(dá)多(見圖1)。通過平均吸光度值比較，發(fā)現(xiàn)A組在2、4、6和8周均明顯高于B組(P<0.01)；2周時(shí)D、E組陽性表達(dá)均高于B、C組(P<0.05～P<0.01)，與A組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4周時(shí)OPG在D組、E組均較A組骨痂組織內(nèi)陽性表達(dá)明顯增多(P<0.01)；6周時(shí)A、D、E組陽性表達(dá)均顯著強(qiáng)于B、C 2組(P<0.01)，E組陽性表達(dá)強(qiáng)于A組(P<0.01)；8周時(shí)A、D、E 3組陽性表達(dá)均明顯高于B、C組(P<0.01)，而A組與D、E組陽性表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

3討論

糖尿病狀態(tài)下，骨礦化降低，骨的生物力學(xué)性能改變，結(jié)構(gòu)強(qiáng)度降低。國外學(xué)者[3-4]在糖尿病動(dòng)物模型骨折愈合觀察中發(fā)現(xiàn)，其骨折愈合處抗折彎力明顯小于非糖尿病組，一般在愈合時(shí)間上落后于非糖尿病組1周左右。

阿侖膦酸鈉是最常用二磷酸鹽類制劑之一。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5]提示二膦酸鹽雖會(huì)抑制骨重建，但對(duì)骨痂形成具有促進(jìn)作用。阿侖膦酸鈉可抑制骨吸收并干擾破骨細(xì)胞附著使破骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，也可通過抑制成骨細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生而抑制破骨細(xì)胞修復(fù)使骨密度增加[6]。WANG等[7]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀局部應(yīng)用能促進(jìn)卵巢切除后大鼠骨折的愈合。MUNDY等[8]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物能明顯促進(jìn)骨形成。嚴(yán)鵬霄等[9]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能同時(shí)發(fā)揮促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的作用。以上述為基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)將此兩種藥物應(yīng)用于糖尿病骨折的治療，探究其作用效果異同。

OPG是骨代謝中的關(guān)鍵因子，可縮短動(dòng)物骨折愈合的時(shí)間，在下頜骨骨折愈合過程中的表達(dá)變化可顯示骨折愈合的程度。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病組OPG含量明顯低于其余4組，對(duì)照組在2、4、6、8周與糖尿病組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，顯示糖尿病骨折后OPG的表達(dá)降低，OPG生成明顯減少，提示糖尿病組在愈合過程中破骨細(xì)胞逐漸分化與成熟，數(shù)量增加且功能活躍，骨吸收增強(qiáng)。而經(jīng)阿侖膦酸鈉及辛伐他汀治療后的2組OPG表達(dá)水平明顯高于糖尿病組及胰島素治療組，提示阿侖膦酸鈉及辛伐他汀可能促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌OPG，顯著提高糖尿病骨折后OPG的表達(dá)，使骨重建向促進(jìn)成骨方向發(fā)展，減少糖尿病對(duì)骨折愈合的負(fù)面影響。研究[10]發(fā)現(xiàn)二磷酸鹽能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞，使OPG分泌增多，使骨吸收作用減弱。KAJI等[11-12]也發(fā)現(xiàn)辛伐他汀作用于成骨細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)OPG的表達(dá)。對(duì)于OPG表達(dá)的促進(jìn)作用，阿侖膦酸鈉組、辛伐他汀組均在骨折后4周即出現(xiàn)OPG表達(dá)的高峰，6、8周逐漸減弱，提示兩藥可能在骨折愈合早期作用顯著。但是，4周時(shí)辛伐他汀組OPG含量略高于阿侖膦酸鈉組，6周時(shí)雖也有所減少，但明顯低于阿侖膦酸鈉組在同一時(shí)間段內(nèi)的減少量，表明辛伐他汀對(duì)糖尿病骨折大鼠OPG分泌的促進(jìn)作用稍強(qiáng)于阿侖膦酸鈉或者其促OPG分泌作用時(shí)間較阿侖膦酸鈉稍長。

綜上所述，阿侖膦酸鈉、辛伐他汀能夠增加糖尿病骨折后的OPG含量，促進(jìn)骨折愈合。發(fā)現(xiàn)藥物治療糖尿病骨折，在糖尿病骨折后的早期應(yīng)用阿侖膦酸鈉有促進(jìn)愈合作用，而辛伐他汀的持續(xù)應(yīng)用療效可能好于阿侖膦酸鈉。但是本研究關(guān)于其對(duì)骨折愈合的最終影響尚未明確，關(guān)于藥物最佳干預(yù)時(shí)間、藥物劑量及給藥方式等仍需進(jìn)一步研究。

q檢驗(yàn)：與A組比較**P<0.01；與B組比較△P<0.05，△△P<0.01；與C組比較#P<0.05,##P<0.01；與D組比較+P<0.05

[參考文獻(xiàn)]

[1]薛江義,張晶晶,盧向東,等.阿侖膦酸鈉聯(lián)合辛伐他汀對(duì)骨質(zhì)疏松骨折的影響[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2014,4(10):20.

[2]徐華,何毅,張鳴號(hào),等.1型糖尿病大鼠模型的建立及糖尿病并發(fā)癥相關(guān)指標(biāo)的測定[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(1):90.

[3]LAMME J,AERSSENS J,NIJS J,etal.Bioehemieal and density assessment of the new bone in later emodeling after eallus distraetion[J].Ortho Paedie Res,1997,15(3):391.

[4]VIERECK V,EMONS G,LAUCK V,etal.Bisphosphonates pamidronate and zoledronic acid stimulate osteoprotegerin production by primary human osteoblasts[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,291(3):680.

[5]LI YF,ZHOU CC,LI J,etal.The effects of combined human parathyroid hormone(1-34)and zoledronic acid treatment on fracture healing in osteoporotic rats[J].Osteoporos Int，2012，23(4):1463.

[6]MARTIN T,GOOI JH,SIM NA.Molecular mechanisms in coupling of bone formation to resorption[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2009,19(1):73.

[7]WANG JW,XU SW,YANG DS,etal.Locally applied simvastatin promotes fracture healing in ovariectomized rat[J].Osteoporos Int,2007,28(12):1641.

[8]MUNDY G,GARRETT R,HARRIS S,etal.Stimulation of bone formationinvitroand in rodenby statins[J].Science，1999，286(5446)：1946.

[9]嚴(yán)鵬霄,崔維頂,胡繼坤,等.阿侖膦酸鈉、辛伐他汀聯(lián)合應(yīng)用治療大鼠骨質(zhì)疏松的作用[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(8):1099.

[10]FUNK JR,HALE JE,CARMINES D,etal.Biomechanical evaluation of early fraeture healing in normal and diabetie rats[J].J Orthop Res，2000,18(1):126.

[11]KAJI H,KANATANI M,SUGIMOTO T,etal.Statins modulate the levels of osteoprotegerin/recetivator of NFκB ligand mRNA in mouse bone-cell cultures[J].Horm Metab Res,2005,37(10):589.

[12]KAJI H,NATIO J,INOUE Y,etal.Statin suppresses apoptosis in osteoblastic cells:role of transforming growth factor-β-smad3 pathway[J].Horm Metab Res,2008,40(11):746.

(本文編輯劉暢)

[文章編號(hào)]1000-2200(2016)03-0296-04·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

[收稿日期]2014-12-30

[作者簡介]孟子煊(1987-)，女，碩士.[通信作者] 李金源，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail：kouqiangxi2008@163.com

[中圖法分類號(hào)]R 782.4；R 587.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.005

[作者單位] 華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔頜面外科，河北 唐山 063000