循環(huán)miR-92a在穩(wěn)定型冠心病合并2型糖尿病血瘀證中的表達

崔亞萌，王文一，王小飛

1.天津市中醫(yī)藥大學(天津 300073)；2.天津市第一中心醫(yī)院

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循環(huán)miR-92a在穩(wěn)定型冠心病合并2型糖尿病血瘀證中的表達

崔亞萌1，王文一2，王小飛2

1.天津市中醫(yī)藥大學(天津 300073)；2.天津市第一中心醫(yī)院

摘要：目的觀察穩(wěn)定型冠心病合并2型糖尿病血瘀證及非血瘀證病人循環(huán)血清miR-92a的表達情況及臨床意義。方法選擇2014年10月—2015年6月住院治療的穩(wěn)定型冠心病合并糖尿病病人60例，按照冠心病血瘀證診斷標準共納入血瘀證組病人30例。非血瘀證組病人30例，另納入17名健康受試者作為對照組。對3組研究對象外周血清進行莖環(huán)實時熒光定量(RT-qPCR)分析，比較miR-92a表達情況，收集病人年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、纖維蛋白原(FIB)，并作出相關性分析。結果與健康對照組相比，穩(wěn)定型冠心病合并糖尿病血瘀證組、非血瘀證組miR-92a水平均較正常組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且血瘀證組較非血瘀證組明顯升高。血瘀證組與健康對照組LDL-C、FIB、HbA1c比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。多因素相關分析顯示miR-92a表達量與FIB、血瘀證積分存在正相關性。結論循環(huán)miR-92a在穩(wěn)定型冠心病合并糖尿病血瘀證中明顯升高，有可能作為早期診斷冠心病合并2型糖尿病血瘀證的客觀生物指標之一。

關鍵詞：冠心病；2型糖尿??；血瘀證；miR-92a；胸痹；心悸；消渴

冠心病合并糖尿病對血管內(nèi)皮的損傷是近年來心血管領域研究的熱點之一，兩種疾病的疊加效應可以加速血管內(nèi)皮的炎性損傷，加快動脈粥樣硬化的進程，增加心腦血管疾病的病死率[1]。中醫(yī)古籍并無冠心病、糖尿病病名，中醫(yī)內(nèi)科學將冠心病歸屬于“胸痹”“真心痛”“心悸”范疇，糖尿病分屬于“消渴”范疇。近年來隨著冠心病合并糖尿病患病率的不斷上升，部分中醫(yī)提出“糖心病”“胸痹消渴”等病名，并結合客觀影像資料、檢驗指標等試圖制訂規(guī)范化的診斷標準?；谥嗅t(yī)“異病同治”的哲學思想及臨床文獻報道，冠心病合并糖尿病總體以本虛標實為主，虛以氣虛、陰虛為主，實則以血瘀、痰濁等病理產(chǎn)物為主，其中血瘀證在冠心病合并糖尿病的中醫(yī)證型中占大多數(shù)，且具有獨特的冠脈病變特點，即病變彌漫、狹窄較重，多支血管病變顯著高于冠心病無糖尿病者。MicroRNA(miRNA)是一種非編碼單股小RNA，能夠在反轉錄水平調(diào)節(jié)基因表達，目前在動脈管壁和血管內(nèi)皮細胞中發(fā)現(xiàn)約40種miRNAs高表達，這些miRNAs對調(diào)節(jié)血管的發(fā)育、創(chuàng)傷修復、氧化還原信號、炎癥應答、血管再生起著重要作用，其中miR-92a是首個在體內(nèi)體外試驗中被證實通過抑制信號通路MKK4-JNK1增加血管內(nèi)皮的增殖和遷移，減少球囊和支架對血管損傷后新生內(nèi)膜的形成，進而降低血管內(nèi)支架再狹窄的發(fā)生率[1-2]。

本研究通過檢測外周血miR-92a在冠心病合并糖尿病血瘀證中的表達，明確其表達情況，以期建立冠心病合并2型糖尿病血瘀證與循環(huán)miR-92a的關系，為早期發(fā)現(xiàn)血管損傷，防治動脈粥樣硬化提供新的生物標記物。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2014年10月—2015年6月住院治療診斷為慢性穩(wěn)定型冠心病合并2型糖尿病病人60例，男39例(65%)，女21例(35%)。按照相關診斷標準分為血瘀證組30例，男21例，女9例，64.73歲±8.22歲；非血瘀證組30例，男18例，女12例，年齡63.70歲±6.58歲。另選正常對照組17名，年齡64.29歲±3.77歲。病人既往診斷有高血壓病29例(48%)，腦卒中6例(10%)，高脂血癥27例(45%)。兩組病人年齡、性別等比較差異無統(tǒng)計學意義。

1.2納入標準慢性穩(wěn)定型冠心病診斷標準：①臨床表現(xiàn)為無心絞痛癥狀的冠心病病人，或2個月內(nèi)心絞痛發(fā)作持續(xù)時間、性質(zhì)、誘因、頻率或緩解方式無明顯變化；②1月內(nèi)無急性心肌梗死或及行冠脈綜合征，和(或)③EKG 具有缺血的ST段變化和(或) T波變化，和(或) ④冠脈CT/造影下冠脈狹窄>50%。

T2DM診斷標準：①空腹血糖(FPG)≥126 mg/dL(7.0 mmol/L)；②OGTT試驗，餐后2 h血糖≥200 mg/dL(11.1 mmol/L)；③具有典型癥狀的高血糖癥或高血糖風險，并且隨機血糖≥200 mg/dL(11.1 mmol/L)(2次以上)；④糖化血紅蛋白≥6.5%。血瘀證診斷標準：結合1986年廣州全國活血化瘀學術會議制定的血瘀證診斷標準[3]，血瘀證積分參考付長庚等[4]制定的冠心病血瘀證診斷標準。

1.3排除標準①1型糖尿病、酮癥、昏迷狀態(tài)；②惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾??；③急性炎癥、出血、妊娠；④嚴重肝腎功能不全、精神心理障礙。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，病人及家屬簽署知情同意書。

1.4樣本采集與處理研究對象均于入院次日晨抽取外周靜脈血2 mL于促凝管中，3 000 r/min離心15 min，取上層血清分裝于無酶EP管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?采集研究對象的一般資料：包括年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)、瘀血癥狀體征(包括舌象、脈象，并予評分)、血脂、糖化血紅蛋白、纖維蛋白原等。 數(shù)據(jù)分析：通過莖環(huán)RT-PCR(stem loop real time polymerase chain reaction)測定研究對象血清miRNA相應CT值，在外參與目的基因擴增效率一致的前提下，表達差異比較采用2-ΔΔCT法。其中miRNA的表達量=2-ΔΔCT。

1.5實驗試劑與儀器

1.5.1試劑Trizol，氯仿，異丙醇，無水乙醇，DEPC水，Takara逆轉錄試劑盒(047A)，Takara熒光定量PCR試劑盒(820A)，引物miR-cel-39，miR-92a(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.5.2儀器高速低溫離心機、PCR儀(德國eppendorf公司)、7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.6莖環(huán)RT-PCR

1.6.1總RNA提取 Trizol加入到200 μL血清中分離總RNA，反復錘打變性后，加入濃度為25 fmol～30 fmol的miR-cel-39，后加入氯仿抽提，劇烈震蕩，靜置5 min，室溫離心12 000 r/min，10 min，小心吸取上清500 μL轉移至1.5 mL EP管中，加入等體積異丙醇混勻-20 ℃沉淀過夜，后傾倒上層，75%無水乙醇DEPC洗滌，4 ℃離心12 000 r/min，5 min，傾倒上層，倒置于干凈濾紙上晾干RNA 2 min～3 min，取15 μL DEPC水溶解RNA，于分光光度計檢測RNA濃度及質(zhì)量，記錄后-80 ℃凍存。

1.6.2逆轉錄反應按照試劑盒在冰上配制反應液，其中RT-primer由miR-cel-39 RT-primer、miR-92a RT-primer代替，目的外參與目的基因分管進行，反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃放置。

1.6.3莖環(huán)RT-PCR按照熒光定量試劑盒配制反應液，其中Forward Primer、Reverse Primer由特異引物代替，反應條件：90 ℃ 30 s 預變性；95 ℃ 5 s 變性，60 ℃ 31 s 退火、延伸，重復40個循環(huán)，70 ℃～95 ℃繪制溶解曲線。每個樣本設3個復孔，反應重復3次分別取平均值。所得CT值即表示每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。。

2結果

2.13組研究對象臨床資料比較3組年齡、性別具有可比性，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1　3組臨床資料比較

2.2各組循環(huán)miR-92a的方差分析miR-92a表達水平在血瘀證組中表達最高，其次為非血瘀證組，在健康對照組中表達最低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中血瘀證組與健康對照組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見表2、圖1。

表2　各組miR-92a水平比較(2-ΔΔCT法)

圖1　 各組miR-92a表達水平比較(#：與健康組比

2.3血瘀證積分與miR-92a的相關性分析與健康對照組比較，非血瘀證組和血瘀證組低密度脂蛋白膽固醇、纖維蛋白原、糖化血紅蛋白(HbA1c)均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。采用多元回歸分析，血瘀證組miR-92a的表達量與FIB、血瘀證積分呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3，圖2。

表3　各組miR-92a表達水平與FIB、血瘀證積分線性相關分析

圖2　血瘀組miR-92a表達水平與FIB、血瘀證積分呈正相關

3討論

近年來，大量研究證實冠心病與血瘀證存在密切聯(lián)系，通過冠脈造影發(fā)現(xiàn)血瘀證與冠脈病變程度、病變范圍呈正相關，且血瘀證積分越高，相關性越明顯[5]。作為其病理產(chǎn)物之一，血瘀證參與冠心病的主要病理環(huán)節(jié)，包括血小板活化、血栓形成、血管狹窄、痙攣，最終導致血管內(nèi)皮結構與功能的損傷；而冠心病合并T2DM病人，長期高血糖狀態(tài)通過各種途徑加重氧化應激，加劇血管內(nèi)皮的損傷。目前已知MiR-92a在主動脈內(nèi)皮細胞和血管內(nèi)皮高表達，Wu等[6]發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中MiR-92a過表達可抑制調(diào)控轉錄因子KLF2的表達，其作為調(diào)節(jié)內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育和血管功能的關鍵因子，在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平調(diào)控一氧化氮合酶(eNOS)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)，表明miR-92a可能在動脈粥樣硬化早期內(nèi)皮損傷的機制中起著重要調(diào)控作用。研究證實冠心病合并T2DM較單純冠心病病人循環(huán)miR-92a表達上調(diào)，提示miR-92a表達與血管內(nèi)皮損傷和功能障礙相關。本研究驗證了穩(wěn)定型冠心病合并2型糖尿病血瘀證組miR-92a較正常組表達升高的基礎上得出血瘀證與非血瘀證miR-92a表達存在差異，表明冠心病合并T2DM血瘀證循環(huán)miR-92a較非血瘀證表達升高，且隨著血瘀證積分的增高，miR-92a表達明顯升高。 本研究相關性分析提示冠心病合并2型糖尿病血瘀證病人循環(huán)miR-92a表達量與FIB呈負相關，與冠心病血瘀證積分呈正相關。冠心病合并糖尿病病人多存在代謝紊亂，糖類、脂類代謝的異常造成血管內(nèi)皮缺氧，氧自由基、炎性因子大量釋放，導致細胞黏附、聚集；巨噬細胞吞噬低密度脂蛋白形成脂質(zhì)斑塊，造成內(nèi)皮損傷。劉芬等[7]通過培養(yǎng)人微血管內(nèi)皮細胞模型證實缺氧后可誘導miR-92a、miR-210表達上調(diào)，進而刺激新生血管，與其相關的信號分子血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)表達亦升高。另外FIB水平、年齡、吸煙、體重指數(shù)都是其危險因素。

本研究的特點之一是將血瘀證與冠心病、2型糖尿病結合，與臨床緊密結合，利于中西醫(yī)病證結合；另一特點為采用莖環(huán)引物實時定量PCR檢測循環(huán)miR-92a。莖環(huán)實時定量PCR是目前公認的靈敏度、特異性均較其他方法顯著的檢測微小RNA的方法，采用基因特異的莖環(huán)引物[8]，既可增強RNA-DNA雜化雙鏈的熱穩(wěn)定性，又能增強莖環(huán)引物所產(chǎn)生的空間約束，但此方法成本較高，不適于大樣本研究。本研究是基于莖環(huán)引物逆轉錄和SYBR Green qPCR檢測法，不僅可通過溶解曲線判斷PCR反應的特異性，且克服了常規(guī)SYBR Green qPCR靈敏度、特異性低的特點，降低成本。

本研究采用改進的SYBR Green qPCR方法研究冠心病合并2型糖尿病血瘀證、非血瘀證病人及健康人血樣miR-92a的表達，并分析miR-92a與FIB血瘀證積分之間的相關性，以期為早期中西醫(yī)結合預防治療冠心病合并糖尿病提供依據(jù)。不足之處在于樣本量較小，且關于miR-92a與下游炎性通路相關炎性因子之間的關系也有待進一步闡述。

參考文獻：

[1] Manni I，Artuso S，Careccia S，et al.The microRNA miR-92 increases proliferation of myeloid cells and by targeting p63 modulates the abundance of its isoforms[J].Faseb Journal，2009，23(11):3957-3966.

[2]Zhang L，Zhou M，Wang Y，et al.miR-92a inhibits vascular smooth muscle cell apoptosis：role of the MKK4-JNK pathway[J].Apoptosis，2014，19(6):975-983.

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[7] 劉芬，婁遠蕾，阮瓊芳，等.內(nèi)皮細胞缺氧后miR-210、miR-92a、miR-126表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2011，51(39):4-5.

[8] 薛慧慧，馬驍驍，朱長保，等.改進莖環(huán)引物RT-PCR法實時定量檢測microRNA.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2014，14(28)：5431-5435.

(本文編輯 薛妮)

基金項目：天津市衛(wèi)生局面上項目(No.2014KY13)

通訊作者：王文一，E-mail：6726392cuicui@sina.com

中圖分類號：R541.6R289.5

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．08．007

文章編號：1672-1349(2016)08-0817-04

(收稿日期：2015-10-27)