Thermusaquaticus DNA連接酶的連接特性研究?

于　欣， 王　靜， 安　然， 梁興國(guó)

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

ThermusaquaticusDNA連接酶的連接特性研究?

于欣， 王靜， 安然， 梁興國(guó)??

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

摘要：為進(jìn)一步研究Thermus aquaticus (Taq) DNA連接酶的作用機(jī)理、開發(fā)以DNA連接作為關(guān)鍵步驟的新生物技術(shù)，本文以含有超穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA(帶有11nt長(zhǎng)的單鏈部分)和另一條單鏈DNA為連接底物，研究了片段長(zhǎng)度、反應(yīng)溫度、連接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性、聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)的添加等對(duì)連接的影響，探討了Taq DNA連接酶的連接特性。連接結(jié)果顯示:單鏈DNA的3’端同發(fā)卡結(jié)構(gòu)I底物相連的連接率，比單鏈DNA的5’端同發(fā)卡結(jié)構(gòu)II底物相連的連接率更高；可以連接的最短單鏈DNA片段的長(zhǎng)度為6nt；在20～65℃范圍內(nèi)，一般連接率隨溫度升高而升高。在連接時(shí)，由2條底物通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)形成的復(fù)合體的熱穩(wěn)定性對(duì)連接率影響不大，一般在連接溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該復(fù)合體的熔點(diǎn)(Melting Temperature, Tm)時(shí)仍有很高的連接率。在70或75℃時(shí)，雖然連接率有所降低，但仍然可以連接9nt的單鏈DNA片段。研究還發(fā)現(xiàn)，在片段連接上，PEG 6000對(duì)較難連接的片段(6～7nt)有促進(jìn)作用，對(duì)容易連接的片段(8～10nt)促進(jìn)作用不顯著，甚至有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞：Taq DNA連接酶；發(fā)卡結(jié)構(gòu)；短片段

引用格式：于欣，王靜，安然，等. Thermus aquaticus DNA連接酶的連接特性研究[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2016, 46(5)： 50-55.

YU Xin, WANG Jing, AN Ran, et al. Investigation of the ligation characteristics of thermus aquaticus DNA ligase[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(5): 50-55.

DNA連接酶在DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過(guò)程中扮演重要角色[1]。它以ATP或NAD+作為輔酶來(lái)催化2個(gè)DNA鏈之間的3’-羥基(3’-OH)和5’-磷酸(5’-P)形成磷酸二酯鍵。這2類連接酶的反應(yīng)機(jī)理相近：(1)NAD+或ATP將其腺苷酰基轉(zhuǎn)移到DNA連接酶賴氨酸殘基的ε-氨基上，形成酶-腺苷酸共價(jià)復(fù)合物中間體，同時(shí)釋放出煙酰胺單核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)然后，酶-腺苷酸共價(jià)復(fù)合物上的腺苷酰基轉(zhuǎn)移到DNA鏈的5’-P，形成被激活的焦磷酸鍵；(3)最后，相鄰鏈的3’-OH與被激活的5’-P結(jié)合在2條鏈之間形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出一磷酸腺苷(AMP)[2-7]。常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶、T4 DNA連接酶和Thermusaquaticus(Taq) DNA連接酶等。T4 DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，是ATP依賴的DNA連接酶，可連接雙鏈DNA的黏性末端和平末端。但它只能在低于37℃的溫度下使用，且對(duì)于堿基錯(cuò)配(Mismatch)不敏感[8]。TaqDNA連接酶熱穩(wěn)定性高，來(lái)源于ThermusaquaticusHB8，是NAD+依賴的連接酶，在45～65℃均有很強(qiáng)的活性[9-10]。

隨著生物技術(shù)的深入發(fā)展，連接酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。例如，T4 DNA連接酶在基因工程中常被用于將目的片段與載體連接，構(gòu)建新的表達(dá)載體；它也可用于連接酶介導(dǎo)的PCR等基因檢測(cè)技術(shù)[11]。但是由于T4 DNA連接酶錯(cuò)配區(qū)分能力較差，連接特異性低，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。而熱穩(wěn)定的TaqDNA連接酶，區(qū)別錯(cuò)配的能力明顯高于T4 DNA連接酶，因此TaqDNA連接酶可更好地應(yīng)用于檢測(cè)技術(shù)。T4 DNA連接酶發(fā)現(xiàn)較早，其連接特性已得到了較深入研究[7,12-13]，但一般認(rèn)為TaqDNA連接酶只能連接較長(zhǎng)的黏性末端或切口部位，對(duì)其連接特性，尤其是短鏈的連接還很少有報(bào)道，因此本研究對(duì)其連接特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，可為開發(fā)與DNA連接酶相關(guān)的生物技術(shù)提供依據(jù)。

由于TaqDNA連接酶的連接溫度較高(65℃)，一般需要足夠長(zhǎng)的DNA雙鏈(>22nt)來(lái)確保該雙鏈在連接溫度下不發(fā)生解鏈[9-10]，很難研究更高溫度(如70℃)的連接特性。另外，使用雙鏈底物時(shí)很難保證連接的寡核苷酸片段以1∶1的比例加入。我們注意到有些短的發(fā)卡結(jié)構(gòu)在高溫下很穩(wěn)定，如環(huán)區(qū)序列為GNA或GNNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)都非常穩(wěn)定。而且發(fā)卡結(jié)構(gòu)在分子內(nèi)形成，一條鏈即可形成連接所需的黏性末端結(jié)構(gòu)，而且莖部只有5～6個(gè)堿基(GC含量較高)時(shí)，其Tm值就可達(dá)到80℃[14-15]。因此，為簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)和降低實(shí)驗(yàn)成本，本研究選用環(huán)區(qū)序列為GAA的穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為連接底物來(lái)探究TaqDNA連接酶的連接特性。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

T4多聚磷酸激酶和0’RangeRulerTM5 bp DNA ladder購(gòu)自Thermo Scientific公司；TaqDNA連接酶購(gòu)自New England Biolabs公司；Eva Green購(gòu)自Biotium公司；短鏈DNA(見表1)由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭籔CR儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司；電泳設(shè)備購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

表1　連接所用穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)和短片段

注：所標(biāo)注的發(fā)卡結(jié)構(gòu)I(Hp-I)分別與I-5～I(xiàn)-10片段進(jìn)行連接反應(yīng)，所標(biāo)注的發(fā)卡結(jié)構(gòu)II(Hp-II)分別與II-5～I(xiàn)I-10片段進(jìn)行連接反應(yīng)。Hp-I ligated to oligonucleotides from I-5 to I-10 and Hp-II ligated to oligonucleotides from II-5 to II-10.

1.2 寡核苷酸片段5’-羥基的磷酸化

在100μL的反應(yīng)體系中含有：1.5mmol/L ATP，1×T4 DNA多聚磷酸激酶緩沖液(50mmol/L Tris-HCl(pH=7.6，25℃)，10mmol/L MgCl2，5mmol/L DTT，0.1mmol/L亞精胺)，20U的T4多聚磷酸激酶，10μmol/L寡核苷酸片段；將含有以上反應(yīng)體系的EP管置于PCR儀上，37℃反應(yīng)4h，75℃ 10min(滅活多聚磷酸激酶)[16]；反應(yīng)后不經(jīng)處理直接用于后續(xù)連接反應(yīng)。

1.3 連接反應(yīng)

在10μL的反應(yīng)體系中含有：1μmol/L發(fā)卡底物，1μmol/L短片段，1×TaqDNA連接酶緩沖液(20mmol/L Tris-HCl(pH=7.6)，25mmol/L KAc，10mmol/L Mg(Ac)2，10mmol/L DTT，1mmol/L NAD和0.1% Triton X-100)，12UTaqDNA連接酶；將含有以上反應(yīng)體系的EP管置于PCR儀上，20～65℃反應(yīng)一定時(shí)間，進(jìn)行電泳分析。

1.4 電泳分析

取1.5μL連接反應(yīng)溶液，用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。電泳后用溴化乙錠染色15min后置于凝膠成像儀(Gel Doc XR+)上成像。

1.5 Image Lab軟件分析電泳連接率

用Image Lab軟件定量分析條帶的亮度，具體的連接率由以下公式計(jì)算。

Y=aε/(aε+b)。

式中：Y為連接率;a為連接產(chǎn)物的條帶的亮度；b為未連接發(fā)卡結(jié)構(gòu)I或II條帶的亮度；ε為修正系數(shù)。

片段連接后因堿基數(shù)的增多亮度會(huì)增加，計(jì)算連接反應(yīng)率時(shí)應(yīng)予以修正，因此引入修正系數(shù)ε。假定堿基對(duì)的數(shù)目同DNA染色后的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算6～10nt片段的修正系數(shù)分別是：0.71、0.69、0.67、0.65和0.63。

2結(jié)果

2.1 底物設(shè)計(jì)

本研究的連接溫度主要采用20～65℃，需要發(fā)卡底物的熔點(diǎn)至少65℃，因此擬采用環(huán)區(qū)序列為GAA的穩(wěn)定性強(qiáng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為連接底物(序列見表1)。發(fā)卡結(jié)構(gòu)I(見圖1-I中發(fā)卡)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)II(圖1-II中發(fā)卡)的莖干區(qū)堿基數(shù)分別是7和8bp，單鏈部分都是11nt，用于同連接的單鏈DNA結(jié)合(見圖1)。測(cè)得其Tm值(Melting temperature)在65℃左右，滿足研究對(duì)于連接底物穩(wěn)定性的要求。發(fā)卡結(jié)構(gòu)I和II分別有3’突出的黏性末端和5’突出的黏性末端，可以研究連接反應(yīng)的方向性對(duì)連接率的影響，連接原理見圖1。

2.2 不同長(zhǎng)度片段連接情況

本研究采用15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析連接產(chǎn)物，圖2A和2B分別是結(jié)構(gòu)I序列組和結(jié)構(gòu)II序列組分別在20、37、45和65℃下連接12h的電泳結(jié)果。

(I：3’突出黏性末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)與5～10nt短片段的3’連接；II：5’突出黏性末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)與5～10nt短片段的磷酸化的5’連接.●:TaqDNA連接酶。I: Hairpin with 3’-sticky end ligated to the 3’-end of 5～10 nt fragments; II: Hairpin with 5’-sticky end ligated to the phosphorylated 5’-end of 5～10 nt fragments. ●:TaqDNA ligase.)

圖1TaqDNA連接酶對(duì)不同長(zhǎng)度單鏈DNA片段連接原理圖

Fig.1Scheme ofTaqDNA ligase ligating

single-stranded DNA of various lengths

由于連接產(chǎn)物比未連接產(chǎn)物長(zhǎng)5～10個(gè)堿基，因此連接后遷移率顯著降低，足以同原料完全分開，便于進(jìn)行定量分析。未連接的短片段由于過(guò)短而未能染色，電泳圖上未顯示(見圖2)。從圖2A可以看出結(jié)構(gòu)I序列組，5nt片段在不同溫度下沒(méi)有連接產(chǎn)物，即使延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間到96h也未發(fā)現(xiàn)發(fā)生連接(數(shù)據(jù)未顯示)；6～10nt片段的連接率隨片段長(zhǎng)度增長(zhǎng)而增加；6～10nt在45℃時(shí)連接率最高，在20～45℃的范圍內(nèi)連接率隨溫度升高而升高。圖2B顯示，對(duì)于結(jié)構(gòu)II，5nt片段也不連接，能連接的6～10nt片段的連接率也隨片段長(zhǎng)度增長(zhǎng)而升高；6～10nt片段在20～65℃范圍內(nèi)的連接率隨溫度升高而升高。

(L: Ladder；N：負(fù)對(duì)照。A:5～10nt片段(見圖1，Hp-I)與發(fā)卡底物Hp-I在20、37、45和65℃溫度下連接12h產(chǎn)物電泳圖。B：5～10nt片段(見圖1，Hp-II)與發(fā)卡底物Hp-II在20、37、45和65℃溫度下連接12h產(chǎn)物電泳圖。L:Ladder; N: Negative control. A： Hp-I ligated to fragments from I-5 to I-10 for 12 h. B： Hp-II ligated to fragments from II-5 to II-10 for 12 h.)

圖2不同溫度下各片段連接產(chǎn)物電泳圖

Fig.2Effects of reaction temperature on the

ligation efficiency of various fragments

綜上所述：(1)圖2A和2B比較分析，結(jié)構(gòu)I相同長(zhǎng)度片段同一溫度下連接率明顯高于結(jié)構(gòu)II連接率；(2)結(jié)構(gòu)I和結(jié)構(gòu)II序列組中，只有5nt片段無(wú)法連接；(3)TaqDNA連接酶所能連接的最短片段是6nt長(zhǎng)的片段，但是除45℃外，其他溫度連接率都很低；(4)不同片段長(zhǎng)度連接率不同，大致連接率順序是10nt>9nt>8nt>7nt>6nt；(5)溫度越高連接率越高，但是6nt片段在65℃時(shí)連接率遠(yuǎn)低于45℃。

2.3 不同長(zhǎng)度片段的連接速率比較和反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響

要詳細(xì)研究反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)連接效率的影響，需要對(duì)連接情況進(jìn)行定量分析。本文采用Image Lab軟件對(duì)電泳得到的各個(gè)條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算出產(chǎn)物的連接率，分析結(jié)果如圖3所示。圖3A和3C分別是結(jié)構(gòu)I和結(jié)構(gòu)II在45℃下同6～10nt片段產(chǎn)物的連接率隨時(shí)間變化的折線圖。明顯看出，片段越長(zhǎng)連接速度越快。如結(jié)構(gòu)I，10nt片段在3h就已完全連接，而6nt片段在48h時(shí)連接率只有91.8%(見圖3A)。對(duì)于結(jié)構(gòu)II，不同長(zhǎng)度的片段之間的連接速度差別更大(見圖3C)。為了進(jìn)一步比較溫度對(duì)各長(zhǎng)度片段連接效率的影響，考察了在各溫度下反應(yīng)6h的定量分析結(jié)果(見圖3B(結(jié)構(gòu)I)和圖3D(結(jié)構(gòu)II))?？傮w看來(lái)，連接率隨溫度升高而增加。例如，對(duì)于7nt連接片段和Hp-I(結(jié)構(gòu)I)的連接，以及8～10nt片段和Hp-II(結(jié)構(gòu)II)的連接，都是溫度越高連接率越高。而8～10nt片段和Hp-I(結(jié)構(gòu)I)的連接，45和65℃在現(xiàn)有條件下看不出差別。在55℃下連接時(shí)，連接率介于45和65℃之間(數(shù)據(jù)未顯示)，對(duì)以上結(jié)論影響不大。我們還試驗(yàn)了70和75℃下9nt片段同Hp-I(結(jié)構(gòu)I)的連接，發(fā)現(xiàn)連接率明顯下降，但有意思的是即使在75℃高溫時(shí)仍有較多產(chǎn)物產(chǎn)生，說(shuō)明TaqDNA連接酶在75℃仍有活性(見圖4)。意外的是，采用另外設(shè)計(jì)的連接體系發(fā)現(xiàn)，15nt長(zhǎng)的片段在75℃下的連接率甚至高于65℃的連接率(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 PEG 6000對(duì)連接率的影響

據(jù)報(bào)道PEG 6000對(duì)有些連接反應(yīng)有促進(jìn)作用，本研究在連接體系中加入PEG，探索PEG對(duì)短片段連接的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)I和結(jié)構(gòu)II在不同溫度，不同連接時(shí)間，與短片段(6和7nt)連接，加入PEG后連接率有一定升高，而較長(zhǎng)片段(8～10nt)加入PEG后促進(jìn)作用下降甚至發(fā)生抑制作用(數(shù)據(jù)未顯示)?，F(xiàn)以差異較明顯的結(jié)構(gòu)I在45℃、反應(yīng)3h條件下的連接產(chǎn)物為例，介紹PEG對(duì)連接反應(yīng)的影響。根據(jù)圖5可以發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)I在PEG加入后，6nt片段的連接率從10.6%增加到20.6%，7nt片段從33.1%增加到61.6%，8～10nt片段連接率在加入PEG后反而有所下降。

(A：45℃條件下6～10nt片段與發(fā)卡底物Hp-I(見圖1，結(jié)構(gòu)I)在不同時(shí)間的連接率。B：6～10nt片段與發(fā)卡底物Hp-I(見圖1，結(jié)構(gòu)I)在不同溫度下連接6h連接率。C：45℃條件下6～10nt片段與發(fā)卡底物Hp-II(見圖1，結(jié)構(gòu)II)片段在不同時(shí)間的連接率。D：6～10nt片段與發(fā)卡底物Hp-II(見圖1，結(jié)構(gòu)II)在不同溫度下連接6h連接率。A： Ligation ratio of hairpin-I ligating to the fragments from I-6 nt to I-10 nt at 45℃. B： Ligation ratio of hairpin-I ligating to I-6 nt～I(xiàn)-10 nt at various temperatures for 6 h. C： Ligation ratio of hairpin-II ligating to the fragments from II-6 nt to II-10 nt at 45℃. D： Ligation ratio of hairpin-I ligating to I-6 nt～I(xiàn)-10 nt at various temperatures for 6 h.)

圖3反應(yīng)時(shí)間以及溫度對(duì)不同長(zhǎng)度片段連接率的影響

Fig.3Effects of reaction time and temperature on ligation ratio of various length fragments

(L：Ladder；N：不加連接酶空白對(duì)照Negative control.)

圖5　PEG對(duì)6-10nt片段(I)的連接率的影響(45℃連接3h)

3討論

本文利用穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)探索了TaqDNA連接酶在不同條件下的連接情況。通過(guò)比較2種結(jié)構(gòu)在不同溫度下與不同長(zhǎng)度片段的連接率，發(fā)現(xiàn)3’突出黏性末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(Hp-I)更易與短片段連接。研究結(jié)果顯示，對(duì)于足夠長(zhǎng)的黏性末端TaqDNA連接酶所能連接的最短DNA片段是6nt。另外，總結(jié)不同溫度下各片段的連接情況得出，片段與底物結(jié)合穩(wěn)定性對(duì)連接率的影響遠(yuǎn)低于TaqDNA連接酶的活性對(duì)它的影響。在20～65℃內(nèi)連接率會(huì)隨著溫度升高而升高。

3.1 2種結(jié)構(gòu)對(duì)連接率的影響

同一長(zhǎng)度的片段在相同溫度下，結(jié)構(gòu)Ⅰ的連接率明顯高于結(jié)構(gòu)II的連接率。說(shuō)明3’端突出的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接率明顯高于5’端突出的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的連接率。有研究指出5’-P端長(zhǎng)度對(duì)連接率有較大影響，在一定范圍內(nèi)5’-P端雙鏈越長(zhǎng)連接率越高[17]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)構(gòu)I中作為連接底物的發(fā)卡結(jié)構(gòu)5’-P端有8bp的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，提供了足夠的與TaqDNA連接酶結(jié)合的空間，但是在結(jié)構(gòu)II中，只有當(dāng)5’-P化片段由6nt增長(zhǎng)到8nt時(shí)連接率才會(huì)明顯提高。Doherty和Dafforn的研究指出T7 DNA連接酶可以連接5’-P端長(zhǎng)7～9nt和3’-OH端長(zhǎng)3～5nt的片段[18]。Chorella virus DNA連接酶可以結(jié)合5’-P端長(zhǎng)11～12nt和3’-OH端長(zhǎng)8～9nt的片段[19]。T4 DNA連接酶以非對(duì)稱的方式結(jié)合在存在缺口的封端雙鏈DNA上，最短可以結(jié)合5’-P端長(zhǎng)6nt和3’-OH端長(zhǎng)5nt的DNA[17]。由此得出以ATP為輔酶的連接酶與底物結(jié)合，需要在5’-P端長(zhǎng)度長(zhǎng)于3’-OH端時(shí)才能進(jìn)行。同時(shí)本研究結(jié)果顯示以NAD+為輔酶的TaqDNA連接酶，在一定范圍內(nèi)5’-P端雙鏈越長(zhǎng)連接率越高。其次，由于TaqDNA連接酶更容易使結(jié)構(gòu)I的DNA腺苷?；Y(jié)構(gòu)II的單鏈DNA很難同TaqDNA連接酶和NAD+作用生成中間體，從而結(jié)構(gòu)I連接效率明顯高于結(jié)構(gòu)II連接效率。

3.2 片段長(zhǎng)度、溫度和PEG 6000對(duì)連接率的影響

酶的活性、片段與底物的結(jié)合穩(wěn)定性是影響連接率的主要因素。5nt片段無(wú)法連接，可能是片段太短，缺乏連接酶與連接片段緊密結(jié)合的位點(diǎn)，導(dǎo)致無(wú)法連接；6nt長(zhǎng)的片段連接率很低，可能是片段太短酶很難識(shí)別，也有可能是片段與底物結(jié)合太不穩(wěn)定從而導(dǎo)致連接率很低；隨著片段增長(zhǎng)，片段與底物結(jié)合穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而連接率升高；酶的活性隨溫度升高(20～65℃)而升高，溫度升高連接率也不斷升高。

5～10nt片段與發(fā)卡結(jié)合用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0估算其Tm值大約是19.2～35.2℃，即在20～35℃時(shí)片段與發(fā)卡底物才能結(jié)合的較穩(wěn)定。但研究結(jié)果顯示20℃時(shí)6～10nt片段與發(fā)卡底物結(jié)合較穩(wěn)定，但其連接率遠(yuǎn)低于65℃時(shí)底物與發(fā)卡底物結(jié)合不穩(wěn)定時(shí)的連接率。結(jié)果顯示，溫度越高反而連接率越高，而且在20℃時(shí)TaqDNA連接酶的活性明顯低于65℃，由此說(shuō)明酶活性對(duì)連接率的影響要明顯高于片段與底物結(jié)合穩(wěn)定性的影響。

6～7nt片段中加入PEG后連接率升高，原因可能是：(1)PEG的存在會(huì)使連接酶或酶與底物復(fù)合物穩(wěn)定性增強(qiáng)：(2)由于大分子的簇?fù)碜饔?，促進(jìn)短片段和發(fā)卡底物與酶的相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合穩(wěn)定性對(duì)連接率的影響并不是很大，所以對(duì)于較易連接的8～10nt片段，加入PEG后促進(jìn)作用顯著下降，甚至有一定的抑制作用。Pheiffer和Zimmerma曾指出在大分子的作用下如PEG 6000可以促進(jìn)黏性末端和平末端DNA的連接[20]。Hayashi等人也發(fā)現(xiàn)PEG 6000既能促進(jìn)分子間連接又能促進(jìn)分子內(nèi)連接[21]。而本研究的結(jié)果顯示PEG可能還有一定的抑制作用，這與已有的研究不同，可能原因是之前研究都是在底物復(fù)合物較穩(wěn)定的情況下進(jìn)行的，而本研究是在底物復(fù)合物不穩(wěn)定的條件下進(jìn)行的。

綜上所述，在高溫下與發(fā)卡底物結(jié)合不穩(wěn)定的短片段也能連接，且在一定范圍內(nèi)(20～65℃)連接率隨溫度升高而升高。片段長(zhǎng)度，PEG和連接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性對(duì)連接率也有很大影響。更高溫度(75℃甚至80℃)下TaqDNA連接酶的活性更高，溫度升高后錯(cuò)配結(jié)合的可能性降低，從而使TaqDNA連接酶在檢測(cè)遺傳疾病、病原體和病毒等方面有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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責(zé)任編輯朱寶象

Investigation of the Ligation Characteristics ofThermusaquaticusDNA Ligase

YU Xin, WANG Jing, AN Ran, LIANG Xing-Guo

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract：Background: DNA ligation is significant for both molecular biology and biotechnology. The ligation detail of T4 DNA ligase has been well studied and found that ligation can occur even when mismatched base pairs are present. Such scenario should be avoided when T4 DNA ligase is used for sequence specific DNA detection in which only positive result is expected for full matched case. On the other hand, the ligation characteristics of Thermus aquaticus (Taq) DNA ligase have not been studied in detail, especially for the temperature dependence. To further investigate the mechanism of Taq DNA ligase for the development of new biotechnologies using DNA ligation, here we used thermal stable DNA hairpin containing a 11 nt overhang and another single-stranded DNA as substrates to evaluate the effect of fragment length, temperature, structure of ligation sites, polyethylene glycol (PEG) concentration on DNA ligation by Taq DNA ligase . Results and Discussion: The results showed that structure of ligation substrates affected DNA ligation greatly. The yield of ligation between short DNA and hairpin I with 3' overhang was much higher than that between hairpin II with 5' overhang and short DNA with 5'-phosphate. Interestingly, 6 nt short DNA could be ligated to both hairpin structures although the efficiency was not high. The difference in ligation efficiency may be caused by the differences of forming ligation intermediate attaching AMP. Usually, 12 nt sticky ends are suggested to be used as ligation substrate, but we found 7 or 8 nt DNA could be ligated efficiently. This finding facilitated the molecular design of DNA detection technology. The ligation yield increased gradually with the increase of temperature from 20 to 65℃. Even for 8 or 9 nt short DNA which forms duplex (with its complementary sequence) with a Tm as low as 30℃, unexpectedly, the ligation efficiency was higher at 65℃than that at 45 or 55℃. This demonstrated that the complex of DNA ligase and 5’-phosphate substrate could help the hybridization. Even at 70 or 75℃, the 9 nt single stranded DNA could still ligate to the substrate, although the efficiency became lower. It is obvious that the mismatched substrate should be difficult to be ligated. The results also revealed that PEG 6000 improved the ligation of short fragments (6～7 nt) but not long ones (8～10 nt). Conclusions: Surprisingly, Taq DNA ligase could ligate a single-stranded DNA as short as 6 nt. Even for DNA as short as 8～9 nt, higher temperature (>65℃) gave higher yield of ligation. Structure Hp-I was found to be a better substrate because it has 5'phosphate, and could form the intermediate with Taq DNA ligase. These results are significant for developing DNA detection technology based on DNA ligation.

Key words:Taq DNA ligase; hairpin; short fragment

基金項(xiàng)目：? 山東省自然科學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201204)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201327)資助

收稿日期：2015-02-17；

修訂日期：2015-05-09

作者簡(jiǎn)介：于欣(1990-)，女，碩士生，研究方向：生物工程。E-mail:yuxinhello2008@163.com ??通訊作者： E-mail:liangxg@ouc.edu.cn

中圖法分類號(hào)：Q783.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-5174(2016)05-050-06

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150057

Supported by Fund for Distinguished Young Scholars of Shandong Province (JQ201204); The National Natural Science Fund (31201327)