?；撬釋θ焉锲谛∈笞訉m平滑肌收縮的抑制作用*

葛萬文,李菊香,袁國強(qiáng),王東萍

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省人民醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730000)

?

?；撬釋θ焉锲谛∈笞訉m平滑肌收縮的抑制作用*

葛萬文1,李菊香1,袁國強(qiáng)2△,王東萍3

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省人民醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730000)

[摘要]目的探討牛磺酸對縮宮素預(yù)收縮的妊娠小鼠離體子宮平滑肌收縮作用的影響。方法建立小鼠離體子宮平滑肌收縮模型，觀察累積加入不同水平的?；撬釋s宮素誘導(dǎo)的小鼠離體子宮平滑肌收縮的影響。高效液相色譜法檢測妊娠期、足月臨產(chǎn)小鼠子宮平滑肌中牛磺酸水平變化。結(jié)果?；撬?5×10-3～4×10-2mol/L)對縮宮素(0.005 U/L)誘導(dǎo)的妊娠期小鼠離體子宮平滑肌的收縮有濃度依賴性的抑制作用，其平均最大抑制效應(yīng)(Emax)值為(40.72±3.69)%；?；撬徇x擇性轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)競爭性拮抗牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用。牛磺酸(5×10-3～4×10-2mol/L)對未孕小鼠離體子宮平滑肌的收縮也具有濃度依賴性的抑制作用，其抑制作用弱于妊娠組，Emax值為(26.63±3.58)%。妊娠期小鼠子宮平滑肌中?；撬崴阶灾性衅陂_始顯著降低，晚孕期后則逐漸回升。結(jié)論?；撬峥赡芡ㄟ^抑制電壓依賴性鈣通道介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流對孕鼠離體子宮平滑肌的收縮有濃度依賴性抑制作用。

[關(guān)鍵詞]?；撬?；子宮；肌細(xì)胞，平滑?。灰种谱饔?；轉(zhuǎn)運(yùn)

?；撬?Taurine)是動物體內(nèi)一種含硫β-氨基酸，它以游離氨基酸形式廣泛分布于腦、視網(wǎng)膜、心臟、骨骼肌及子宮等組織和器官中[1]。?；撬釋Χ嗥鞴俸拖到y(tǒng)有著相當(dāng)重要的作用，主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)、視覺、心血管、內(nèi)分泌、免疫及生殖等系統(tǒng)，對維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓平衡及清除氧自由基等發(fā)揮著重要作用[2-4]。已有研究證實(shí)?；撬釋π∧c、氣管平滑肌具有舒張作用[5]，以此為切入點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)旨在研究其對縮宮素誘導(dǎo)的妊娠期小鼠離體子宮平滑肌收縮作用的影響，為?；撬嶙鳛樾滦捅Ｌニ幪峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級C57BL/6小鼠100只，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。雄鼠30只，雌鼠70只，體質(zhì)量25～30 g，日齡60～80 d。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按雌(60只):雄(30只)為2∶1的比例合籠交配，每晨作陰道涂片，以發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)天定為妊娠第0天。早孕期為孕7 d，中孕期為孕12 d，晚孕期為孕18 d，將晚孕期雌鼠用于子宮平滑肌肌張力測定。健康未孕雌鼠(10只)作為對照組。

1.1.2藥品和試劑?；撬?批號TB0926)、β-丙氨酸(批號A6168)，純度大于或等于98%，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；縮宮素注射液(5 U/mL，批號H34022980)，購于安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司；常規(guī)試劑，國產(chǎn)分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；HS-4B精密恒溫浴槽(成都儀器廠)；JZ100肌肉張力換能器(高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司)；Waters1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2方法

1.2.1離體子宮平滑肌的制備取C57BL/6雌性妊娠小鼠，頸椎脫臼處死，暴露腹腔，迅速剪取子宮，沿血供側(cè)小心縱向剖開全層子宮平滑肌，去除胎鼠及胎盤，用PBS緩沖液清洗干凈。在體視解剖鏡下，將子宮內(nèi)膜與平滑肌分離，制成一段約3 mm×10 mm子宮平滑肌肌條，得到的肌條一份立即放入盛有經(jīng)混合氣(95%O2+5%CO2)飽和的37.50 ℃ De-Jalon液(NaCl 9.40 g、KCl 0.42 g 、NaHCO30.50 g、CaCl20.06 g、葡萄糖 0.50 g，蒸餾水稀釋至1 000 mL)的培養(yǎng)皿中，另一份生理鹽水清洗后立即于液氮冷凍，之后-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2離體子宮平滑肌收縮模型的制備將子宮平滑肌肌條用絲線結(jié)扎兩端，下端系于L型通氣鉤上固定，置于盛有20 mL De-Jalon液的恒溫浴槽中，上端連接張力換能器。恒溫浴槽內(nèi)的溫度保持在(37.00±0.50)℃，并向其中勻速通入混合氣體。換能器與BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)相連，肌條負(fù)荷1 g，平衡30 min，待系統(tǒng)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入0.005 U/L的縮宮素，待肌條收縮平穩(wěn)，即出現(xiàn)規(guī)律收縮波形時，視為離體子宮平滑肌收縮模型建立成功。

1.2.3子宮平滑肌肌張力記錄離體子宮平滑肌收縮模型建立成功后，第1組以累加的方式加入?；撬幔乖〔蹆?nèi)藥物終濃度分別為5×10-3、1×10-2、2×10-2、4×10-2mol/L，加藥間隔15 min，記錄子宮平滑肌收縮情況。第2組提前15 min添加?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)，之后添加?；撬?4×10-2mol/L)，記錄有拮抗劑存在時子宮平滑肌收縮情況。對照組累積加入相同濃度的生理鹽水，記錄子宮平滑肌收縮情況。

1.2.4妊娠期、產(chǎn)后和健康未孕小鼠子宮平滑肌中?；撬崴降臏y定通過離體子宮制備法獲得早孕、中孕、晚孕、產(chǎn)后和健康未孕小鼠的子宮平滑肌，采用柱前衍生法，以鄰苯二甲醛為衍生劑，β-巰基乙醇為保護(hù)劑，應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測定子宮平滑肌中?；撬崴健?/p>

1.2.5計(jì)算平均最大抑制效應(yīng)(Emax)值以給藥前15 min縮宮素(0.005 U/L)誘導(dǎo)的子宮平滑肌平均收縮幅度作為基礎(chǔ)值，給予每一個藥物濃度后，子宮平滑肌平均收縮幅度作為效應(yīng)值。子宮平滑肌收縮抑制率(%)=(基礎(chǔ)值-效應(yīng)值)/基礎(chǔ)值×100%，計(jì)算出Emax值。

2結(jié)果

2.1?；撬釋θ焉锲谛∈箅x體子宮平滑肌收縮的影響?；撬?5×10-3、1×10-2、2×10-2、4×10-2mol/L)能濃度依賴性地抑制縮宮素(0.005 U/L)誘導(dǎo)的妊娠小鼠子宮平滑肌的持續(xù)收縮(表1)，在濃度為4×10-2mol/L時其抑制效應(yīng)達(dá)到最大，Emax為(40.72±3.69)%。?；撬?4×10-2mol/L)對妊娠小鼠子宮平滑肌收縮的這種抑制作用能夠被牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)拮抗，Emax為(9.94±0.46)%。

2.2?；撬釋ξ丛行∈箅x體子宮平滑肌收縮的影響 不同濃度?；撬?5×10-3、10-2、2×10-2、4×10-2mol/L)能劑量依賴性地抑制縮宮素(0.005 U/L)引起的未孕小鼠子宮平滑肌的持續(xù)性收縮(表2)，Emax為(26.63±3.58)% 。但?；撬釋ξ丛行∈蟮倪@種抑制作用要弱于對妊娠期小鼠子宮平滑肌的抑制，見圖1。

表1　不同濃度?；撬釋θ焉锲谛∈笞訉m平滑肌收縮的

a：P<0.05，b：P<0.01,與生理鹽水比較。

表2　不同濃度牛磺酸對未孕小鼠子宮平滑肌收縮的

a：P<0.05，b：P<0.01,與生理鹽水比較。

a：P<0.05，b：P<0.01,與未孕組比較。

圖1不同濃度?；撬釋s宮素誘導(dǎo)的妊娠期、未孕小鼠子宮平滑肌收縮的影響

2.3小鼠子宮平滑肌中?；撬崴綔y定未孕小鼠子宮平滑肌中?；撬釣?8.94±0.37)μmol/L，而妊娠期小鼠子宮平滑肌中?；撬嵩谠缭衅谧兓⒉幻黠@，自中孕期開始明顯降低(P<0.05)，晚孕期后出現(xiàn)緩慢回升，直至足月臨產(chǎn)(PP1)及產(chǎn)后(PP2)恢復(fù)到正常水平，見圖2。

*：P<0.05，與D1～D6比較。

圖2?；撬嵩谛∈蟛煌焉镫A段子宮平滑肌中的水平

3討論

?；撬嶙鳛槿梭w條件性必需氨基酸，是調(diào)節(jié)機(jī)體正常生理功能、維持機(jī)體自穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，近年來其研究越來越受到人們的重視[6]。臨床上已將?；撬嵊糜陬A(yù)防性治療心血管疾病、糖尿病等[7-9]。但是，至今國內(nèi)外尚未見?；撬釋ψ訉m平滑肌作用的報(bào)道。

?；撬嵬ㄟ^兩種途徑集聚于細(xì)胞內(nèi)。(1)機(jī)體自身合成，但合成能力較弱，一般不能充分滿足機(jī)體自身需求；(2)通過細(xì)胞膜上?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體將血漿?；撬峥缒まD(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，以保證機(jī)體所需。?；撬嵬ㄟ^細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)機(jī)體牛磺酸生物“穩(wěn)態(tài)”，以發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[10]。牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(taurine transporter,TAUT)存在于細(xì)胞膜上，不同種屬間具有同源性，是Na+、Cl-依賴性的Na+-K+-ATPase供能的轉(zhuǎn)運(yùn)體。機(jī)體內(nèi)存在多種類型的TAUT，且各型TAUT分布不同，使得各組織細(xì)胞的TAUT攝入?；撬岬牧坎煌?，以調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)外?；撬崞胶?，發(fā)揮其生物學(xué)作用。目前已克隆出多種TAUT亞型，如從大鼠腦cDNA庫中克隆出?；撬?β-丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，此轉(zhuǎn)運(yùn)體可轉(zhuǎn)運(yùn)牛磺酸和β-丙氨酸[11]。本實(shí)驗(yàn)表明，?；撬釋s宮素誘導(dǎo)的妊娠和未孕小鼠子宮平滑肌的收縮均具有濃度依賴性的抑制作用，β-丙氨酸競爭性拮抗?；撬釋θ焉镄∈笞訉m平滑肌收縮的抑制作用，且對妊娠小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用要強(qiáng)于對未孕小鼠子宮平滑肌的作用。在妊娠期內(nèi)子宮基本處于靜息狀態(tài)，只有在足月臨產(chǎn)時才會出現(xiàn)高頻率、高強(qiáng)度的收縮，這種狀態(tài)的轉(zhuǎn)化與子宮平滑肌細(xì)胞收縮性和興奮性相關(guān)分子的表達(dá)有關(guān)。子宮平滑肌細(xì)胞興奮性的高低取決于細(xì)胞膜電位，細(xì)胞膜表達(dá)的鉀離子通道對膜電位的維持起著至關(guān)重要的作用，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)則是妊娠子宮平滑肌細(xì)胞最主要的鉀離子通道[12-14]。縮宮素通過激活子宮平滑肌細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道(PDC)使Ca2+向肌細(xì)胞內(nèi)流，前列腺素作為Ca2+載體與Ca2+形成復(fù)合體并將其帶入肌細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)游離Ca2+作為肌肉興奮-收縮偶聯(lián)的活化劑，與肌動蛋白、肌漿蛋白結(jié)合引起子宮收縮[15]。?；撬嶙鳛闄C(jī)體內(nèi)源性Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑，維持著細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。牛磺酸通過激活BKCa通道，使BKCa活化，K+外流，膜超極化，使電壓依賴性鈣通道失活，胞內(nèi)Ca2+水平下降，引起肌細(xì)胞舒張。β-丙氨酸作為TAUT抑制劑，可與牛磺酸競爭性的結(jié)合TAUT，引起細(xì)胞內(nèi)?；撬岷慕?。本實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先加入的β-丙氨酸與子宮平滑肌細(xì)胞膜上?；撬?β-丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相結(jié)合，競爭性抑制細(xì)胞對?；撬岬臄z取，造成?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)障礙，使得胞內(nèi)?；撬崴较陆担瑴p弱?；撬釋a2+的調(diào)節(jié)作用。

在不同的妊娠階段，機(jī)體內(nèi)分泌環(huán)境發(fā)生顯著變化，子宮平滑肌中牛磺酸水平存在差異，早孕期胚胎剛剛形成，子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)牛磺酸水平維持在較高水平，隨著妊娠時間的增加，中孕期以后?；撬崴斤@著降低，之后則逐漸緩慢回升，表明在妊娠初期子宮平滑肌細(xì)胞通過其胞膜上的TAUT將?；撬嵊砂廪D(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，胞內(nèi)高水平的?；撬嵬ㄟ^抑制平滑肌的收縮為胚胎生長發(fā)育提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，隨著妊娠的繼續(xù)進(jìn)行，胚胎發(fā)育逐漸成熟，?；撬嵊纸?jīng)TAUT轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，?；撬崴浇档停蕴幱谙鄬Ψ€(wěn)定的水平，以保證胚胎的正常發(fā)育，預(yù)防早期流產(chǎn)的發(fā)生，直至足月臨產(chǎn)后恢復(fù)到正常水平。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌的收縮具有濃度依賴性的抑制作用，β-丙氨酸對?；撬崾鎻堊訉m平滑肌作用的拮抗效應(yīng)提示?；撬岬氖鎻堊饔门c其跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，可能主要通過抑制電壓依賴性鈣通道介導(dǎo)的胞外Ca2+內(nèi)流實(shí)現(xiàn)。牛磺酸幾乎無毒性作用，無抗原性，各種給藥方式均易吸收，有望成為早期妊娠時保胎的制劑，以減少孕期流產(chǎn)的發(fā)生。

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Inhibitory effects of taurine on contraction of pregnant mouse uterine smooth muscle*

GeWanwen1,LiJuxiang1,YuanGuoqiang2△,WangDongping3

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics;2.ResearchInstituteofNeurology,SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China;3.DepartmentofHematology,GansuProvincialPeople′sHospital,Lanzhou,Gansu730000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of taurine on the contraction action of uterine smooth muscle in vitro in pregnant mouse.MethodsThe contraction model of in vitro mouse uterine smooth muscle was established.The influence of accumulated adding different levels of taurine on the oxytocin induced in vitro uterine smooth muscle contraction was observed.The change of taurine levels in isolated uterine smooth muscle was also evaluated by high-performance liquid chromatography(HPLC).ResultsTaurine (5×10-3-4×10-2mol/L) had the concentration- dependently inhibiting effect on oxytocin-induced uterine smooth muscle contractions in pregnant mouse.The average maximal inhibiting effect(Emax) value was (40.72±3.69)%.The taurine selective transport inhibitor beta-alanine(7×10-2mol/L) competitively antagonized the inhibiting effect of taurine on the contraction action of isolated uterine smooth muscle.Taurine (5×10-3-4×10-2mol/L) also concentration-dependently inhibited the contractions of isolated uterine smooth muscle from non-pregnant mouse with the Emax value of (26.63±3.58)%,but its inhibiting effect was weaker than that of pregnant mouse.The concentration of taurine in uterine smooth muscle was significantly decreased from middle pregnancy and was gradually increased after late pregnancy.ConclusionTaurine has the concentration-dependent inhibiting effect on the contraction of pregnant mouse isolated uterine smooth muscle possibly via the blockage of extracellular Ca2+influx mediated by potential-dependent calcium channel.

[Key words]taurine;uterus;myocytes,smooth muscle;inhibition;transport

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.001

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81341100)；甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(130RJYA033)； 蘭州大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(861642)。

作者簡介：葛萬文(1984-)，實(shí)習(xí)研究員，碩士研究生，主要從事藥物對平滑肌運(yùn)動的研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel：13893292173；E-mail：yuangq06@163.com。

[中圖分類號]R337.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)04-0433-03

(收稿日期：2015-08-11修回日期：2015-10-12)