CAPE-NO2預(yù)處理對CCl4引起的小鼠肝損傷的保護(hù)作用*

游　莉，董　志，路曉欽

(1.西南大學(xué)醫(yī)院藥劑科，重慶 400715；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；3.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700)

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CAPE-NO2預(yù)處理對CCl4引起的小鼠肝損傷的保護(hù)作用*

游莉1，董志2△，路曉欽3

(1.西南大學(xué)醫(yī)院藥劑科，重慶 400715；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016；3.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700)

[摘要]目的研究對硝基咖啡酸苯乙酯(CAPE-NO2)對CCl4誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。方法小鼠分為7組，每組10只。分組：正常組，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)組，模型組，CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(1.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+ CCl4組。各組腹腔注射給藥15 d，正常組和模型組給生理鹽水0.1 mL/10 g。第15天給藥結(jié)束后，正常組和CAPE-NO2組腹腔注射橄欖油溶液(0.1 mL/10g)，其余各組腹腔注射0.15%CCl4橄欖油溶液(0.1 mL/10 g)。測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、三酰甘油(TG)水平，肝組織勻漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、過氧化氫酶(CAT)活性。取肝左葉經(jīng)10%多聚甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查和TUNEL染色。結(jié)果CAPE-NO2能顯著降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清ALT、AST活性、TG水平，升高小鼠肝組織中CAT、GSH-Px的活性，且呈藥效劑量依賴性。CAPE-NO2能明顯減少肝細(xì)胞損傷和降低肝細(xì)胞凋亡率，且作用強(qiáng)于CAPE。結(jié)論CAPE-NO2對小鼠化學(xué)性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能與增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧酶的水平，提高機(jī)體清除自由基能力和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]肝；損傷；四氯化碳；對硝基咖啡酸苯乙酯；保護(hù)作用

咖啡酸苯乙酯(CAPE)是蜂膠中的一種主要活性組分，屬于多酚類化合物，是一種強(qiáng)抗氧化劑，有清除自由基的功效。在抗氧化[1]、延遲肝纖維化[2]、保護(hù)由CCl4誘導(dǎo)的肝損傷[3]和阻止甲氨蝶呤引起的肝腎氧化損傷[4]等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的藥理作用。前期有實(shí)驗(yàn)研究，通過對CAPE鄰二羥基進(jìn)行修飾，得到咖啡酸苯乙酯的一種衍生物，即對硝基咖啡酸苯乙酯(CAPE-NO2)，顯示出比咖啡酸苯乙酯更強(qiáng)的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[5]。本文采用CCl4所致小鼠肝損傷模型，研究CAPE-NO2對肝損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為尋找有效的抗氧化物質(zhì)治療肝臟疾病提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康昆明小鼠70只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0006。

1.1.2藥品及試劑CAPE-NO2由西南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室提供；四氯化碳(CCl4)，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100925；市售橄欖油；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；TG試劑盒為上海繼錦化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品。

表1　CAPE-NO2對CCl4致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST 和TG的影響

a：P<0.01，與正常組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4組比較。

A:正常組；B:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)組;C:模型組；D:CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4組；E:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4組。

圖1小鼠肝臟病理切片(HE×200)

1.1.3儀器JY92．2D型超聲波細(xì)粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；1901型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；組織勻漿機(jī)(江蘇麒麟貝爾)；LEICA2135 轉(zhuǎn)速切片機(jī)(德國LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組和給藥小鼠分為7組，每組10只。分組：正常組，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)組，模型組，CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(1.0 mg/kg)+ CCl4組，CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+ CCl4組。各組腹腔注射給藥15 d，正常組和模型組給生理鹽水0.1 mL/10g。第15天給藥結(jié)束后，正常組和CAPE-NO2組腹腔注射橄欖油溶液(0.1 mL/10 g)，其余各組腹腔注射0.15%CCl4橄欖油溶液(0.1 mL/10 g)，禁食，16 h后心臟采血，并分離小鼠肝臟，檢測各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.2.2肝組織勻漿制備及其酶學(xué)指標(biāo)測量小鼠血樣4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取血清，自動(dòng)生化分析儀檢測血清ALT、AST和TG的活性。腹腔分離肝臟，用冰生理鹽水洗去多余血漬等，用濾紙拭干，天平稱質(zhì)量，以體積質(zhì)量比= 9∶1置于冷凍的生理鹽水中，制備10%肝組織勻漿，將勻漿置于4 ℃冷凍離心機(jī)離心(4 000 r/min，10 min)。取出上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行GSH-Px和CAT水平測定。

1.2.3肝臟組織的病理切片觀察用4 ℃生理鹽水沖洗肝臟后，濾紙吸干，取距肝左葉邊緣0.5 cm處同一部位的一小塊肝組織，于10%多聚甲醛固定液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4組織凋亡檢查(TUNEL染色)取肝左葉經(jīng)10%多聚甲醛固定采用TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法按試劑盒說明書進(jìn)行。顯微鏡(×200)觀察，拍攝圖譜，用Image-ProPlus 6.0分析凋亡率。

2結(jié)果

2.1CAPE-NO2對ALT、AST和TG的影響與模型組比，CAPE-NO2各劑量組均能顯著降低CCl4所引起的ALT、AST、TG的升高(P<0.01)，且具有濃度依賴性。CAPE-NO2(2.0 mg/kg、1.0 mg/kg)降低作用與CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2CAPE-NO2對GSH-Px活性和CAT活性的影響與模型組比，CAPE-NO2各劑量組均能顯著升高GSH-Px與CAT在血清中的水平，且具有濃度依賴性。CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4升高作用明顯優(yōu)于同劑量的CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4組，見表2。

2.3CAPE-NO2對組織病理變化的影響顯微鏡觀察各組小鼠肝組織，正常組和CAPE-NO2組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，無水腫、無脂肪變性，見圖1。模型組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞明顯的脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)形成脂滴，可見小泡性脂變，細(xì)胞核固縮較嚴(yán)重；胞質(zhì)解離，可見炎癥細(xì)胞浸潤。CAPE(2.0 mg/kg) + CCl4組癥狀較模型組有所減輕，但肝細(xì)胞仍可見明顯氣球樣變；CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4組僅在中央靜脈周圍有脂肪變性，肝細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)完整。

2.4CAPE-NO2對CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的影響用TUNEL法檢測各組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況。正常組和CAPE-NO2(2.0 mg/kg)組細(xì)胞顯藍(lán)色，小鼠肝組織凋亡細(xì)胞較少。模型組經(jīng)DAB顯色陽性細(xì)胞呈棕黃色，表明大量的細(xì)胞凋亡，與正常組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+CCl4組的凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.01)，與同劑量的CAPE相比CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4組肝組織細(xì)胞凋亡率更低(P<0.01)，見圖2。

表2　肝組織中GSH-Px與CAT活性的變化

a：P<0.01，與正常組比較；b：P<0.05，c：P<0.01,與模型組比較；d：P<0.05，與CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4組比較。

A:正常組；B:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)組；C:模型組；D:CAPE(2.0 mg/kg)+ CCl4組；E:CAPE-NO2(2.0 mg/kg)+ CCl4組;a：P<0.01，與正常組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4組比較。

圖2CAPE-NO2對CCl4所致肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的DAB染色(×200)

3討論

肝損傷是由多種因素參與的復(fù)雜過程，當(dāng)肝臟內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡被打破后，會(huì)產(chǎn)生大量過剩自由基，將會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞大小膜泡的形成、膜通透性流動(dòng)性喪失、DNA損傷及誘發(fā)細(xì)胞凋亡，在造成肝損傷同時(shí)氧自由基也可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖和膠原合成，促進(jìn)肝纖維化形成[6-9]。

肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷后，胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST溢出，使血漿ALT、AST升高[10]，這在一定程度上反映了肝細(xì)胞的損傷程度，因此血漿ALT、AST升高被認(rèn)為是判斷急性肝損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[11]。有研究表明，CAPE對CCl4所誘引的化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用，明顯降低CCl4等復(fù)合因素誘導(dǎo)大鼠肝損傷的ALT和AST水平[12]。本研究中，CAPE-NO2對ALT、AST和TG無顯著影響，表明CAPE-NO2本身不對肝組織造成損傷。CAPE-NO2可使CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清ALT、AST和TG水平顯著下降，且有明顯的藥物量效關(guān)系。且CAPE-NO2(2.0 mg/kg、1.0 mg/kg)對ALT、AST和TG的降低作用優(yōu)于CAPE(2.0 mg/kg)。研究表明，CCl4肝損傷早期肝臟CAT活性降低。GSH-Px催化GSH參與過氧化反應(yīng)，清除在細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[13]；GSH-Px和CAT能與SOD等酶相互配合，最終可起到預(yù)防肝損傷或修復(fù)肝損傷的作用[14]。有研究表明，CAPE明顯升高肝損傷大鼠GSH水平和增加CAT活力[15]。本研究中，CAPE-NO2和CAPE均能顯著升高由CCl4引起的GSH-Px和CAT水平下降，且CAPE-NO2升高作用更加顯著，表明CAPE-NO2能提高細(xì)胞清除自由基的能力，減輕自由基對肝細(xì)胞攻擊發(fā)生的損傷，CCl4急性肝損傷模型組小鼠肝臟HE染色可見肝細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮、核溶解等變化并伴有炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變。CAPE-NO2對肝損傷保護(hù)效果較CAPE更好。凋亡是正常細(xì)胞現(xiàn)象，但也可被許多外部因素激發(fā)，肝細(xì)胞凋亡發(fā)生在肝發(fā)育和成人肝的肝細(xì)胞更新時(shí)，也發(fā)生在各種病毒、免疫、腫瘤和藥物引起的肝臟疾病。實(shí)驗(yàn)中可見TUNEL陽性細(xì)胞核染成棕色，與周圍肝細(xì)胞比，體積縮小、核固縮明顯。CAPE-NO2與同劑量的CAPE比較，CAPE-NO2具有更強(qiáng)的抗肝細(xì)胞凋亡能力。

綜上所述，CAPE-NO2可使CCl4肝損傷小鼠血清ALT、AST和TG水平顯著下降，可通過增強(qiáng)肝細(xì)胞抗氧酶的水平提高機(jī)體清除自由基能力，減少肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝臟的病理損傷。作為一種半合成、具有鄰二酚羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的CAPE-NO2對化學(xué)性肝損傷具有明確的保護(hù)作用，預(yù)示了其在防治肝細(xì)胞損傷等疾病中的應(yīng)用前景，具有開發(fā)利用成為肝臟保護(hù)劑的可能。

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Protective effect of p-nitro caffeic acid phernethyl ester on liver injury induced by CCl4in mice*

YouLi1，DongZhi2△，LuXiaoqin3

(1.DepartmentofPharmacy,SouthwestUniversityHospital，Chongqing400715，China；2.CollegeofPharmacy,ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China；3.DepartmentofPharmacy，ChongqingNinthPeople′sHospital，Chongqing400700，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of p-nitro caffeic acid phernethyl ester(CAPE-NO2) pretreatment on liver injury induced by CCl4 in mice.MethodsA total of 70 mice were divided into 7 groups,normal group,CAPE-NO2(2.0 mg/kg) group,model group,CAPE(2.0 mg/kg)+CCl4 group,CAPE-NO2(1.0 mg/kg) group+CCl4 group and CAPE-NO2(0.5 mg/kg)+CCl4 group.Each group was given the intraperitoneal medication for 15 d.Normal saline 0.1 mL/10 g was given in the normal group and the model group.After15 d medication,the normal group and the CAPE-NO2 group were itraperitoneally injected by olive oil solution 0.1 mL/10 g,the other groups by 0.15% CCI4-olive oil solution(0.1 mL/10 g).The serum ALT,AST and TG levels and GSH-Px activity and CAT activity in liver homogenate were measured.The left hepatic lobe was taken and fixed by 10%paraformaldehyde for conducting the histopathological examination and TUNEL staining.ResultsCAPE-NO2 could significantly reduce serum ALT and AST activities and TG level in mice with CCl4 induced liver damage,and increased the CAT and GSH-Px activities in liver tissue with a dose-dependent manner.CAPE-NO2 could significantly reduce the hepatocellular injury and decreased the hepatocellular apoptosis rate,moreover its effect was stronger than that of CAPE.ConclusionCAPE-NO2 has certain protective effect on mice chemical liver injury,its mechanism might be associated with enhancing the antioxidase level of liver cells and increase the capability for scavenging free radicals and inhibiting apoptosis.

[Key words]liver;injury；carbon tetrachloride；p-nitro caffeic acid phenethyl ester；protective effects

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.06.008

基金項(xiàng)目：重慶市科委重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(Cstc2011ggc10006-33)。

作者簡介：游莉(1981-)，主管藥師，碩士，主要從事臨床藥理學(xué)研究。△通訊作者，E-mail:zhidong073@hotmail.com。

[中圖分類號(hào)]R961

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)06-0743-04

(收稿日期：2015-07-18修回日期：2015-09-25)