骨保護(hù)素/核因子κB受體活化因子配體在甲狀旁腺激素調(diào)控下頜骨牽張成骨中的表達(dá)效應(yīng)

李永頔　朱鵬娜　王冬香　陳嘉民　唐正龍貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽 550004

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骨保護(hù)素/核因子κB受體活化因子配體在甲狀旁腺激素調(diào)控下頜骨牽張成骨中的表達(dá)效應(yīng)

李永頔朱鵬娜王冬香陳嘉民唐正龍
貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽 550004

[摘要]目的研究甲狀旁腺激素（PTH）調(diào)控下頜骨牽張成骨中骨保護(hù)素（OPG）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，探討PTH促進(jìn)牽張成骨的作用機制。方法建立兔下頜骨牽張成骨模型，隨機分為實驗組和對照組。實驗組隔日皮下注射不同劑量PTH，對照組隔日皮下注射生理鹽水。酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中OPG的水平，免疫組織化學(xué)法研究OPG、RANKL在下頜骨牽張成骨新骨中的表達(dá)。結(jié)果在牽張期血清OPG水平逐漸升高；在牽張結(jié)束時，實驗組OPG表達(dá)最強，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隨固定期的延長，OPG的表達(dá)逐漸下降，而RANKL的表達(dá)逐漸增強。結(jié)論間隙性皮下注射PTH可上調(diào)OPG表達(dá)，加速骨代謝，促進(jìn)下頜骨牽張區(qū)新骨生成。

[關(guān)鍵詞]甲狀旁腺激素； 牽張成骨； 核因子κB受體活化因子配體

Supported by: The National Natural Science Foundation of China(81160130).Correspondence: Tang Zhenglong, E-mail: zhenglongtang@hotmail.com.

牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）是通過對切開后的骨段施加特定大小的牽引或擴張力，使骨段間隙內(nèi)再生新骨以延長或擴寬骨骼，達(dá)到矯治骨發(fā)育不足或修復(fù)骨缺損的一種外科技術(shù)。而如何提高牽張成骨新骨生成速度一直是該領(lǐng)域的熱門研究課題。新骨的形成和代謝受多種因素的調(diào)節(jié)，包括激素及其受體、細(xì)胞因子等。甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的維持機體內(nèi)鈣磷代謝平衡的一種重要的調(diào)鈣激素，能夠調(diào)節(jié)骨骼的合成代謝和分解代謝過程。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)PTH影響骨骼代謝主要依賴于PTH給予劑量和方式，持續(xù)高劑量的給予PTH能增加骨吸收，而間歇性小劑量應(yīng)用PTH具有成骨效能。PTH可促進(jìn)牽張成骨新骨生成[3-5]，但目前尚未見應(yīng)用不同劑量PTH促進(jìn)頜骨牽張成骨分子機制研究的文獻(xiàn)報道。在骨改建過程中，骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）和核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）為關(guān)鍵調(diào)控分子，OPG/RANKL在牽張成骨新骨生成過程中起重要調(diào)控作用[6]。本實驗通過建立兔下頜骨牽張成骨實驗動物模型，在牽張過程中給予不同劑量PTH，檢測牽張成骨過程中OPG和RANKL的表達(dá)，為PTH促進(jìn)下頜骨牽張成骨調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物

選用貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的SPF級新西蘭大耳白兔45只，5個月齡，質(zhì)量（2.5±0.2） kg，雌雄不限。

1.2主要試劑和材料

OPG、RANKL即用型免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），rhPTH（1-34）（Tocris公司，英國），兔專用下頜牽張器（寧波慈北醫(yī)療器械有限公司）。

1.3分組

將實驗動物隨機分成實驗組（A、B、C、D組）和對照組，每組9只。對照組頸部隔日皮下注射生理鹽水1 mL，A、B、C、D組隔日皮下注射10、 20、30、40 μg·kg-1rhPTH（1-34），給藥至動物處死。

1.4建立兔下頜牽張成骨模型

3%戊巴比妥鈉給予動物耳緣靜脈麻醉，術(shù)區(qū)消毒。隨機選取一側(cè)下頜骨行牽張成骨術(shù)。在下頜骨下緣作切口，長2.5 cm。切開皮膚、皮下組織、肌肉及筋膜，翻瓣，暴露下頜骨外側(cè)面，于第一磨牙和頦孔間作下頜骨垂直截骨，安放牽張器（圖1）。經(jīng)5 d延遲期后牽引延長下頜骨。牽張速率為1 mm·d-1，每次0.5 mm，每日2次，牽張10 d后固定2周。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA）檢測血清OPG水平變化

于牽張第3天、第8天及牽張結(jié)束、固定1周和2周時于耳緣靜脈采血2 mL，分離血清后凍存?zhèn)錂z血清OPG水平。

1.6新骨組織標(biāo)本獲取與處理

各組實驗動物于牽張結(jié)束時、固定1周、固定2周時處死3只實驗動物，取牽張區(qū)新生骨標(biāo)本用4%多聚甲醛溶液固定48 h，20%乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣，乙醇逐級脫水，石蠟包埋，沿牽張方向做5 μm厚連續(xù)切片。

圖1　放置頜骨牽張器Fig 1　Placed the distractor

1.7免疫組織化學(xué)方法檢測OPG和RANKL的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)SABC法檢測牽張區(qū)新生骨組織中OPG和RANKL的表達(dá)。利用HMIAS圖像分析系統(tǒng)作陽性細(xì)胞積分光密度值（integral optical density，IOD）測定，在100倍視野下每張切片選擇5處相同面積（200 μm×200 μm）的陽性細(xì)胞最密集處進(jìn)行測定，取其平均值為該切片陽性細(xì)胞的IOD。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清中OPG的水平變化

各組血清中OPG隨牽張期時間的延長逐漸升高，到牽張10 d時達(dá)到最高值，之后隨固定期的延長逐漸下降。到固定2周時，各組仍高于術(shù)前基礎(chǔ)值。在牽張3 d、牽張8 d、固定2周時，B、C、D組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在牽張10 d時，各實驗組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在固定1周時，C、D組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C組血清OPG水平最高，但與其他實驗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

2.2OPG在牽張區(qū)新骨中的表達(dá)

牽張10 d時，OPG在牽張區(qū)的梭形細(xì)胞和鄰近成熟骨的髓腔中呈陽性表達(dá)，在新生骨小梁的骨細(xì)胞和周圍的成骨細(xì)胞也呈陽性表達(dá)（圖2）。固定1周時，各組的陽性表達(dá)都較牽張10 d時有所減弱，OPG在梭形細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的表達(dá)強度減弱，但在骨細(xì)胞和骨髓腔中OPG表達(dá)仍較強。固定2周時，OPG在梭形細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的表達(dá)強度更弱，但各組OPG在骨細(xì)胞和骨髓腔中仍呈陽性表達(dá)。

表1　牽張成骨不同時期血清OPG的水平變化Tab 1　The serum levels of OPG in different period of DO　ng·L-1, n=3,±s

表1　牽張成骨不同時期血清OPG的水平變化Tab 1　The serum levels of OPG in different period of DO　ng·L-1, n=3,±s

注：#表示同時期與對照組比較，P<0.05。

組別　　基礎(chǔ)值　　牽張3 d　　牽張8 d　　牽張10 d　　固定1周　　固定2周對照組　880.63±16.50　909.38±16.50　960.63±15.46　1 037.00±2.47　1 005.00±12.37　934.50±1.06 A組　896.25±17.26　930.54±16.81　982.68±17.37　1 070.42±17.02#　1 021.25 ±16.39 　936.75±1.41 B組　896.88±23.22　941.88±24.36#1 002.50±22.03#1 077.00±2.47#1 033.75±10.61　946.50±1.06#C組　895.42±17.56　967.92±16.65#1 072.92±15.07#　1 212.25±15.56#　1 125.00±1.77#　967.50±1.77#D組　888.75±12.50　947.92±12.58#1 017.92±10.10#　1 121.75±9.90#1 060.75±11.31#　950.50±4.60#

圖2　牽張10 d時牽張區(qū)新骨組織中OPG的表達(dá)　SABC　× 400Fig 2　The expression of OPG in the new bone tissue of distraction gap at the 10th day after DO　SABC　× 400

染色強度IOD測定結(jié)果顯示：牽張10 d時，B、C、D組染色強度高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。固定1周時， C、D組的陽性染色強度與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。固定2周時，各實驗組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。C組染色強度最高，但與其他實驗組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.3RANKL在牽張區(qū)新骨中的表達(dá)

下頜牽張延長結(jié)束時，RANKL與OPG的表達(dá)部位基本相同，但其陽性表達(dá)強度與OPG相反，其陽性表達(dá)較弱。固定1周時，RANKL的陽性表達(dá)強度較牽張10 d時有所增強。實驗組和對照組在骨細(xì)胞和骨髓腔中呈陽性表達(dá)。固定2周時，RANKL的陽性染色更強，實驗組和對照組在骨細(xì)胞和骨髓腔中陽性表達(dá)均較強（圖3）。

表2　不同時期牽張區(qū)新骨中OPG的表達(dá)Tab 2　The expression of OPG in the new bone tissue of distraction gap in each period

圖3　固定2周時牽張區(qū)新骨組織中RANKL的表達(dá)SABC×400Fig 3　The expression of RANKL in new bone tissue of distraction gap at the 2nd week consolidation SABC　×400

染色強度IOD測定結(jié)果顯示：下頜牽張延長結(jié)束時，實驗組較對照組的陽性染色強度弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。固定1周時， B、C、D組的陽性染色弱于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。固定2周時， C、D組的陽性染色強度高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3　不同時期牽張區(qū)新骨組織RANKL的表達(dá)Tab 3 The expressions of RANKL in new bone tissue of distraction gap in each period

3　討論

PTH是重要的鈣平衡調(diào)節(jié)激素，對骨代謝具有雙重調(diào)節(jié)作用，既促進(jìn)骨形成又促進(jìn)骨吸收。研究[7]發(fā)現(xiàn)間歇性地補充外源PTH可以增強新生小鼠骨骼中間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化、 定向增生，同時可抑制成骨細(xì)胞譜系的凋亡，而成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間相互作用是骨重塑的關(guān)鍵，破骨細(xì)胞是PTH發(fā)揮局部作用的重要靶細(xì)胞，在骨重建過程中，OPG 和RANKL為其關(guān)鍵調(diào)控分子[8]。RANKL與破骨細(xì)胞前體表面結(jié)合，刺激破骨細(xì)胞前體的增殖，相互融合成多核的破骨細(xì)胞。而OPG作為一種可溶的誘餌受體，能與RANKL競爭性結(jié)合，從而阻斷RANKL/ RANK信號通路，抑制破骨細(xì)胞的激活、分化、成熟和吸收功能，還可能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[9]。RANKL表達(dá)增加，可導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化、激活和成熟，從而導(dǎo)致骨吸收活動增強。OPG作為誘導(dǎo)受體與RANK結(jié)合，競爭性抑制RANKL與RANK間信號傳遞，具有抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞發(fā)生的能力，從而抑制破骨細(xì)胞的分化、激活和成熟，抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成[6]。研究[10]認(rèn)為OPG是牽張成骨的重要調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)新骨的形成。Tang等[11]研究發(fā)現(xiàn)PTH可促進(jìn)下頜骨牽張成骨新骨生成，增加牽張區(qū)新骨骨密度。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，OPG主要定位于新骨組織中的成纖維細(xì)胞及增殖活躍的成骨細(xì)胞。在牽張中、末期和固定期1周組織中，OPG表達(dá)水平都較高；隨著固定期的延長，新生骨逐漸成熟，大量成骨細(xì)胞被埋入鈣化的骨基質(zhì)中，OPG表達(dá)水平下降，在成骨細(xì)胞中只有微弱表達(dá)。在牽張結(jié)束時，實驗組OPG表達(dá)最強，且與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而RANKL在固定期表達(dá)逐漸增強，在固定2周時，RANKL的陽性染色更強。在新骨生成過程中，RANKL/OPG是調(diào)控新骨生成的一個重要杠桿。本實驗中RANKL/OPG的值是不斷變化的，隨著牽張期的結(jié)束成骨細(xì)胞的分化成熟，OPG的陽性表達(dá)下降，而RANKL的陽性表達(dá)上升，表明新骨成熟期OPG的合成和分泌減少，抑制破骨細(xì)胞分化的作用也減弱，從而使得RANKL的表達(dá)水平上升，最后失去對破骨細(xì)胞的促分化和激活作用，從而使骨吸收和骨形成達(dá)到平衡。

不同劑量PTH促進(jìn)牽張成骨新骨生成質(zhì)量存在一定差異，但目前關(guān)于促進(jìn)牽張成骨新骨生成的適宜PTH劑量尚不清楚。Aleksyniene等[12-14]研究顯示每天使用25 μg·kg-1和5 μg·kg-1兩種劑量PTH均可提高兔脛骨牽張區(qū)新骨礦化程度，但同時發(fā)現(xiàn)25 μg·kg-1皮下注射對新骨的礦化程度更有效。Ali等[4]通過建立大鼠下頜牽張成骨模型，每周3次皮下注射60 μg·kg-1PTH，結(jié)果顯示應(yīng)用PTH組牽張區(qū)新骨平均骨容量大于對照組。本研究發(fā)現(xiàn)，各實驗組血清OPG水平和新骨中OPG表達(dá)強度存在差異，在牽張早期，C組的OPG表達(dá)最高，RANKL表達(dá)最低，提示在下頜骨牽張成骨過程中，隔日皮下注射PTH 30 μg·kg-1能更有效地促進(jìn)下頜骨牽張成骨新骨生成。

PTH與牽張應(yīng)力同時作用于成骨細(xì)胞，新骨生成受牽張信號和PTH激素兩方面的調(diào)控，這必然導(dǎo)致新骨生成的調(diào)控機制更復(fù)雜。外源性小劑量PTH間隙給予后，可能通過刺激骨髓微環(huán)境中成骨活性基因表達(dá)，或促進(jìn)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖分化，增加成骨細(xì)胞數(shù)量，延緩成骨細(xì)胞凋亡而延長其壽命，從而促進(jìn)骨合成代謝，促進(jìn)骨小梁和骨密質(zhì)表面新骨沉積，增加骨的厚度和強度。據(jù)Tang等[15]研究發(fā)現(xiàn)小劑量間歇性皮下注射PTH（1-34）可通過增加成骨細(xì)胞數(shù)量、上調(diào)OPG表達(dá)而促進(jìn)下頜骨缺損修復(fù)。本實驗結(jié)果表明PTH可增加OPG在牽張期和固定早期表達(dá)，在新骨成熟期OPG的表達(dá)逐漸減低。OPG可能在PTH促進(jìn)下頜牽張成骨的新骨生成過程中扮演十分重要的角色。

應(yīng)用外源性PTH可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增生，較好地提高下頜骨牽張成骨新骨的生成。其可能的作用機制是在牽張期及固定早期PTH可以增加OPG表達(dá)，抑制RANKL的表達(dá)，加速骨代謝及骨轉(zhuǎn)換水平，從而促進(jìn)下頜骨牽張區(qū)新骨的生成。但是對于PTH促進(jìn)牽張成骨新骨生成的最適劑量、治療持續(xù)時間、每天給藥和周期性給藥的比較等諸多問題仍需要進(jìn)一步研究。

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（本文采編石冰）

Osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-κB ligand expression in mandibular distraction osteogenesis regu-lated by parathyroid hormone

Li Yongdi, Zhu Pengna, Wang Dongxiang, Chen Jiamin, Tang Zhenglong.(Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China )

[Key words]parathyroid hormone;distraction osteogenesis;receptor activator of nuclear factor-κB ligand

[Abstract]Objective This research aimed to investigate the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） in mandibular distraction osteogenesis （DO） regulated by parathyroid hormone （PTH）and to explore the mechanism by which PTH promotes DO.MethodsA rabbit mandibular DO model was established.The rabbits were randomly divided into experimental group and control group.The former were subcutaneously injected with different doses of PTH on alternate days, the latter was injected with normal saline every other day.Serum OPG levels were detected through enzyme-linked immunosorbent assay.The OPG and RANKL expression levels in the DO-induced formation of a new bone tissue were examined through immunohistochemistry staining.ResultsThe serum OPG levels gradually increased during distraction.At the end of the stretch, the OPG expression in the experimental group was significantly stronger than that in the control group.As the fixed period was extended, the OPG expression in the new bone gradually decreased, but the RANKL expression increased.ConclusionIntermittent subcutaneous PTH injection can upregulate the OPG expression and accelerate bone metabolism.Thus, this procedure promotes the early generation of a new bone in the mandible through DO.

[中圖分類號]R 782

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.004

[收稿日期]2015-12-12； [修回日期]2016-03-06

[基金項目]國家自然科學(xué)基金（81160130）

[作者簡介]李永頔，碩士，E-mail：lyd8906932@qq.com

[通信作者]唐正龍，教授，博士，E-mail：zhenglongtang@hotmail.com