米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血半暗帶腦血流量及內(nèi)皮素-1蛋白表達(dá)的影響*

陶　濤，甘林望，付　潔，李作孝，李小剛△

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論著·基礎(chǔ)研究

米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血半暗帶腦血流量及內(nèi)皮素-1蛋白表達(dá)的影響*

陶濤1，甘林望2，付潔1，李作孝1，李小剛1△

[摘要]目的探討米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶腦血流量及內(nèi)皮素-1(endothclin-1,ET-1)蛋白表達(dá)的影響。方法采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型，將35只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=15)及米諾環(huán)素組(n=15)。再灌注24 h后，采用Longa法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能，激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大鼠腦缺血半暗帶局部腦血流量，免疫組織化學(xué)法觀察缺血側(cè)皮質(zhì)ET-1蛋白的分布情況，再灌注6、24 h時(shí)放射免疫法定量測(cè)定ET-1蛋白的水平。結(jié)果同假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加(P<0.05)；缺血半暗帶腦血流量明顯減少(P<0.05)，ET-1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，米諾環(huán)素組較模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05)，腦缺血半暗帶局部腦血流量增加(P<0.05)，ET-1蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。結(jié)論米諾環(huán)素可增加大鼠腦缺血后局部腦血流量，抑制ET-1蛋白的表達(dá)，減輕大鼠神經(jīng)功能損害，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]米諾環(huán)素；再灌注損傷；腦血流量；內(nèi)皮素-1

腦卒中是一種因急性腦循環(huán)障礙導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的臨床綜合征。具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率及高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。盡管對(duì)缺血性卒中的病理生理過(guò)程進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，但除在時(shí)間窗內(nèi)給予靜脈溶栓治療外，目前仍缺乏其他有效的治療。因此探索新的治療方法顯得尤為重要[1]。米諾環(huán)素具有抗炎癥、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激及血管保護(hù)活性[2]。前期研究表明，米諾環(huán)素可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及缺血灶周圍神經(jīng)元的凋亡，降低血腦屏障的通透性，減少腦梗死體積從而促進(jìn)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)[3-5]。內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種具有縮血管效應(yīng)的多肽之一[6]。腦血流量的改變會(huì)引起ET-1的合成及釋放[7]?；谝陨侠碚摶A(chǔ)，本研究采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶腦血流量及ET-1蛋白表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料鹽酸米諾環(huán)素(Sigma公司)，激光多普勒血流儀((Moor VMS-LDF，森西科技公司)，大鼠腦立體定位儀(日本東茂公司)，GC-1200型γ計(jì)數(shù)器(中科中佳科學(xué)儀器公司)，ET-1放射免疫試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物技術(shù)研究所)，SP法免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中山金橋公司)，成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～280 g(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，其他相關(guān)試劑均購(gòu)自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥將SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=15)及米諾環(huán)素組(n=15)。從各組中分別選取5只大鼠用于免疫組織化學(xué)及放射免疫檢測(cè)。

1.2.2大鼠腦缺血再灌注模型的制備參照本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[8]。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定于腦立體定位儀上，頸正中切口，分離暴露頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，在ECA主干遠(yuǎn)端作一切口，將線栓插入至大腦中動(dòng)脈(MCA)起始部，固定線栓并縫合傷口。缺血2 h后，將線栓拔出實(shí)施再灌注。假手術(shù)組不插入線栓，其余步驟同模型組。米諾環(huán)素組于缺血再灌注同時(shí)按1 mL/100 g的比例尾靜脈注射3 mg/kg米諾環(huán)素，每日2次。各時(shí)間點(diǎn)大鼠死亡或取材時(shí)造模不成功大鼠被剔除，隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.3實(shí)驗(yàn)取材再灌注6、24 h時(shí)，深度麻醉大鼠后直接斷頭取腦，冰上操作取缺血側(cè)大腦中動(dòng)脈供血腦組織(前囟前1 mm至前囟后2 mm，前囟右側(cè)2 mm)，置于-80 ℃冰箱中保存用于放射免疫檢測(cè)；再灌注24 h時(shí)，經(jīng)4%多聚甲醛灌流固定后，選取缺血區(qū)腦組織制作石蠟切片(片厚4 μm)，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.4局部腦血流量的測(cè)定(rCBF)大鼠麻醉后選取俯臥位，沿正中線剪開(kāi)額頂部皮膚，過(guò)氧化氫暴露顱骨前囟及右側(cè)半顱骨。在前囟右測(cè)2 mm，前囟后1 mm處用牙科鉆打孔至硬腦膜外，將激光多普勒血流監(jiān)測(cè)儀探針垂直固定于骨膜上，監(jiān)測(cè)插線前、MCAO時(shí)及再灌注24 h后各時(shí)間點(diǎn)的腦血流，每次記錄5 min，取其平均值。術(shù)后用骨蠟封上鉆孔，縫合皮膚，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)ET-1的表達(dá)選取大鼠缺血側(cè)腦組織石蠟切片，參照S-P法試劑盒說(shuō)明書(shū)，DAB顯色后光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核棕黃色顆粒為陽(yáng)性著色，計(jì)算ET-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。加入PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.6腦組織內(nèi)ET-1水平的表達(dá)取各組大鼠腦組織稱質(zhì)量后研磨勻漿，加冰浴的生理鹽水制成10%腦勻漿液，在冷凍離心機(jī)中以10 000 g離心10 min，取上清液，參照放射免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定ET-1量，結(jié)果以(pg/g腦組織)表示。

1.2.7神經(jīng)功能評(píng)分再灌注24 h后，采用Longa評(píng)分法[9]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分，無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分，左前肢不能完全伸展；2分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向左側(cè)跌倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。

2結(jié)果

2.1米諾環(huán)素對(duì)缺血半暗帶腦血流量的影響模型組大鼠插入線栓時(shí)缺血半暗帶腦血流量下降到基線值的(55.2±5.0)%，再灌注時(shí)腦血流量迅速恢復(fù)到基線值的(72.1±2.9)%。再灌注24 h后，米諾環(huán)素組大鼠腦缺血半暗帶腦血流量(86.6±2.6)%明顯高于模型組(76.3±3.7)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2大鼠腦組織內(nèi)ET-1蛋白的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)染色顯示，假手術(shù)組腦組織可見(jiàn)少量ET-1陽(yáng)性細(xì)胞，染色淺。缺血再灌注24 h后，模型組缺血灶周圍ET-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加。米諾環(huán)素組與模型組比較，ET-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少。見(jiàn)圖1。

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：米諾環(huán)素組。

圖1免疫組織化學(xué)檢測(cè)腦組織內(nèi)ET-1蛋白的表達(dá)(×200)

a:P<0.05，與假手術(shù)組比較；b:P<0.05，與缺血再灌注組比較。

圖2放射免疫法檢測(cè)米諾環(huán)素對(duì)缺血半暗帶ET-1

蛋白水平的影響(n=5)

2.3米諾環(huán)素對(duì)缺血半暗帶ET-1蛋白水平的影響同免疫組織化學(xué)結(jié)果相似，放射免疫結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠大腦中動(dòng)脈供血區(qū)腦組織ET-1蛋白水平較低。缺血再灌注6 h后，大鼠缺血半暗帶區(qū)ET-1蛋白水平開(kāi)始增加，持續(xù)到再灌注24 h，給予米諾環(huán)素干預(yù)后，各時(shí)間點(diǎn)ET-1蛋白的水平明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4米諾環(huán)素對(duì)大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的影響同假手術(shù)組相比，模型組及米諾環(huán)素組大鼠均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損(P>0.05)。缺血再灌注24 h后，米諾環(huán)素組[(1.6±0.5)分]神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組[(2.8±0.4)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

腦梗死是多種原因引起腦局部血流減少或供血中斷，導(dǎo)致腦組織缺血性壞死。急性腦梗死灶包括中心壞死區(qū)及周圍的缺血半暗帶兩種不同的組織區(qū)域。缺血半暗帶含有大量存活的神經(jīng)細(xì)胞且存在側(cè)支循環(huán)。腦梗死急性期迅速恢復(fù)腦血流量可以改善缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的腦代謝，阻止其發(fā)生不可逆的壞死。因此，腦梗死后改善缺血半暗帶區(qū)域血液灌注是目前腦梗死急性期治療的重要靶點(diǎn)。

激光多普勒血流儀是一種既可以評(píng)價(jià)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，又可以用于檢測(cè)各供血?jiǎng)用}支配區(qū)大腦皮質(zhì)局部腦血流量的技術(shù)。具有實(shí)時(shí)定量、動(dòng)態(tài)連續(xù)及客觀敏感等特點(diǎn)。大鼠局灶性腦缺血模型成功的標(biāo)志為插入線栓后大腦中動(dòng)脈供血區(qū)皮質(zhì)腦血流量迅速下降到基線值的25.0%左右。本研究結(jié)果顯示，腦缺血后缺血半暗帶腦血流量下降了約50.0%，同前期報(bào)道結(jié)果相一致[10]。靜脈給予米諾環(huán)素可以明顯提高大鼠缺血半暗帶局部腦血流量，提示米諾環(huán)素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能與改善缺血半暗帶局部腦血流量有關(guān)。

ET-1是一種廣泛分布于心血管及腦等組織器官，具有強(qiáng)大縮血管效應(yīng)的生物活性多肽。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ET-1在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。大量研究表明ET-1蛋白在缺血性腦損傷過(guò)程中起到重要作用。腦缺血后ET-1異常表達(dá)或釋放增加，參與調(diào)節(jié)血管收縮、腦血流量及神經(jīng)毒性作用。大鼠短暫性腦缺血后，免疫活性的ET-1蛋白分布在缺血灶周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞上。進(jìn)一步采用ELISA檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷的大鼠血液中ET-1蛋白表達(dá)增加[6]。在小鼠缺血缺氧損傷模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ET-1 mRNA均呈高表達(dá)[11]。腦缺血大鼠細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ET-1蛋白水平明顯升高，其表達(dá)水平在一定程度上與神經(jīng)功能的損壞程度緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，缺血半暗帶內(nèi)ET-1蛋白于缺血6 h后就開(kāi)始表達(dá)增加，一直持續(xù)到再灌注后24 h，同Zhang等[6]研究報(bào)道一致。以上研究表明ET-1蛋白水平增加引起血管舒張受限是導(dǎo)致缺血性腦損傷的重要機(jī)制。米諾環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類抗菌藥物，最先被廣泛應(yīng)用于治療嚴(yán)重感染及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。由于其脂溶性高，易于通過(guò)血腦屏障，目前受到神經(jīng)病學(xué)家的廣泛關(guān)注。近期大量研究表明，米諾環(huán)素在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究者采用1型糖尿病大鼠局灶性腦缺血模型研究表明，靜脈聯(lián)合給予米諾環(huán)素和組織性纖溶酶原激活物可以緩解大鼠缺血灶周圍的炎性反應(yīng)，減輕腦水腫，降低腦梗死面積及減少出血轉(zhuǎn)化[5]。一項(xiàng)臨床研究表明，口服200 mg米諾環(huán)素可以促進(jìn)急性腦梗死患者30 d的神經(jīng)功能改善[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，靜脈給予3 mg/kg米諾環(huán)素可緩解大鼠缺血再灌注24 h神經(jīng)功能的損壞，推測(cè)其作用可能與調(diào)節(jié)缺血半暗帶內(nèi)ET-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注損傷后，缺血半暗帶內(nèi)ET-1蛋白表達(dá)升高，腦血管強(qiáng)烈收縮導(dǎo)致局部腦血流量減少，能量代謝中斷，引起腦組織缺血性損傷。米諾環(huán)素能促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與抑制缺血半暗帶內(nèi)ET-1蛋白的表達(dá)，增加局部腦血流量有關(guān)。這為進(jìn)一步闡明米諾環(huán)素促進(jìn)大鼠缺血性腦損傷后神經(jīng)修復(fù)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.神經(jīng)內(nèi)科；2.腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

Effects of minocycline on cerebral blood flow and endothelin-1 protein expression in ischemic penumbra of rats with focal cerebral ischemia reperfusion*

TaoTao1,GanLinwang2,FuJie1，LiZuoxiao1,LiXiaogang1△

(1.DepartmentofNeurology;2.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofXinanMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of minocycline on regional cerebral blood flow and the expression of endothelin-1(ET-1) in ischemic penumbra of rats after focal cerebral ischemia reperfusion injury.MethodsMiddle cerebral artery occlusion (MCAO) with nylon suture was used to be established as focal cerebral ischemia reperfusion mode (I/R),a total of 35 male Sprageue-Dawley rats were randomly divided into 3 groups:sham-operated group(n=10),model group(n=15) and minocycline group(n=15).After 24 hours of I/R,The neurobehavioral function of rats was evaluated by Longa′s test,the regional cerebral blood flow in ischemic penumbra was assessed with laser-Doppler flowmetry.After 6 and 24 hours of I/R,the expression of ET-1 in peri-infarct region was measured by both immunohistochemistry and radioimmunoassay.ResultsCompared with sham-group,the Longa′s test scales,ET-1 protein expression increased and the rCBF decreased in ischemic penumbra in model group(P<0.05).the Longa′s test scales,ET-1 protein expression decreased and the rCBF decreased in ischemic penumbra in minocycline group when compared to the model group(P<0.05).ConclusionMinocycline could promote neurological functional recovery of rats after MCAO,which might be attributed to increase the cerebral blood flow and regulate the endothelin-1 expression in ischemic penumbra.

[Key words]minocycline;reperfusion injury;cerebral blood flow;endothelin-1

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.01.010

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(140032);四川省教育廳資助項(xiàng)目(15ZA0168);瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014S4506);瀘州醫(yī)學(xué)院院級(jí)基金資助項(xiàng)目(2014QN-092)。

作者簡(jiǎn)介：陶濤(1984-)，博士，講師，主要從事腦血管病的神經(jīng)保護(hù)研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail：lixg5948@163.com。

[中圖分類號(hào)]R743.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)01-0027-03

(收稿日期：2015-08-10修回日期：2015-09-16)