腎移植受者多反應(yīng)性抗體與HLA抗體的相關(guān)性研究

榮春書，王偉剛，連　鑫，高寶山*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿系統(tǒng)疾病診治中心，吉林 長春130021)

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*通訊作者

腎移植受者多反應(yīng)性抗體與HLA抗體的相關(guān)性研究

榮春書1，王偉剛2，連鑫2，高寶山2*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 泌尿系統(tǒng)疾病診治中心，吉林 長春130021)

摘要：目的從單克隆抗體水平研究同種異體腎移植受者多反應(yīng)性抗體與HLA抗體的相關(guān)性，探討多反應(yīng)性抗體是否為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體產(chǎn)生的原因之一。方法從腎移植患者外周血細(xì)胞及手術(shù)切除的移植腎組織中分離出B淋巴細(xì)胞，并于體外永生化培養(yǎng)獲得單克隆B細(xì)胞，分別檢測B細(xì)胞分泌的抗體對HLA抗原及凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性。結(jié)果共獲得107個B細(xì)胞克隆，檢測發(fā)現(xiàn)每個B細(xì)胞克隆在體外培養(yǎng)過程中均分泌抗體。其中有4個單克隆B細(xì)胞分泌的抗體可以與多種HLA抗原發(fā)生反應(yīng)，而這些HLA抗原之間并非都有共用的抗原決定簇。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這4種單克隆抗體均可以與凋亡細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)為抗體的多反應(yīng)性。結(jié)論本研究從單克隆細(xì)胞、抗體水平揭示了多反應(yīng)性抗體的存在與HLA抗體的相關(guān)性，在交叉反應(yīng)理論之外，為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體的產(chǎn)生原因提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腎臟移植；多反應(yīng)性抗體；HLA抗體；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:0703)

目前，同種異體腎移植手術(shù)是治療慢性腎功能衰竭的最有效方法。器官移植致敏后產(chǎn)生的抗體主要為特異性抗供者HLA的抗體，即供體特異性抗體(Donor specific antibodies，DSA)，然而研究發(fā)現(xiàn)，腎移植受者血清中亦可檢測出非供體特異性抗體(Non-donor specific antibodies，NDSA)的出現(xiàn)[1-4]，在無特異性免疫致敏的前提下，NDSA產(chǎn)生的原因尚不完全明確。

自然抗體(Natural antibodies)是一類未經(jīng)免疫致敏而廣泛存在于人類血清中的抗體[5]。自然抗體由于能夠與抗原決定簇毫不相關(guān)的多種抗原發(fā)生反應(yīng)，故表現(xiàn)出多反應(yīng)性的特點(diǎn)。自然抗體的重要特性是能夠與凋亡細(xì)胞結(jié)合[6-8]。長期以來，對多反應(yīng)性抗體的研究主要集中于人類自身免疫性疾病領(lǐng)域，而針對多反應(yīng)性抗體在器官移植領(lǐng)域的研究卻罕有報道。鑒于多反應(yīng)性抗體的特性，在本研究中，我們從單克隆B細(xì)胞、抗體水平探尋多反應(yīng)性抗體與HLA抗體產(chǎn)生的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究B淋巴細(xì)胞來源于：①一位腎移植術(shù)后一年患者的液氮中凍存的外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)；②因抗體介導(dǎo)排異反應(yīng)而失功并被手術(shù)切除的移植腎。

1.2方法

1.2.1B淋巴細(xì)胞克隆的分離及免疫純化 將切除的移植腎在超凈臺中剪碎、研磨，并通過70 μm濾網(wǎng)過濾制成細(xì)胞懸液。聚蔗糖溶液中利用密度梯度法將白細(xì)胞從移植腎組織碎片中分離，利用CD19磁珠(BD公司)將CD19+的B淋巴細(xì)胞從白細(xì)胞中免疫純化。

1.2.2B淋巴細(xì)胞的體外永生化在96孔V底細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中加入50 μl由EBV轉(zhuǎn)染的狨猴B95-8細(xì)胞株培養(yǎng)上清液(其內(nèi)含EBV)，再向每孔中加入50 μl含20% FCS的RPMI 1640，含50000個經(jīng)5Gy射線照射的Jurkat細(xì)胞做為支持細(xì)胞。最后向每孔中加入CpG 2006，最終濃度為2.5 μg/ml。將稀釋后的純化B細(xì)胞懸液注入細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中，每孔30個細(xì)胞，將培養(yǎng)板置入37℃ 5% CO2細(xì)胞孵育箱中持續(xù)培養(yǎng)。直至從細(xì)胞培養(yǎng)孔中見到增大的細(xì)胞集落，將永生化的B細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中持續(xù)培養(yǎng)并擴(kuò)增，待各淋巴細(xì)胞克隆增殖至106/ml，收集培養(yǎng)上清液-20℃保存待用。

1.2.3凋亡細(xì)胞制備Jurkat細(xì)胞株0.5×106/ml與200 ng/ml抗FAS抗體于37℃孵育箱內(nèi)15小時。Annexin-V及7-AAD(BD公司)染色以確認(rèn)細(xì)胞凋亡。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液所含抗體對凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性1×106經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的Jurkat細(xì)胞分別與100 μl B細(xì)胞克隆培養(yǎng)上清液在FACS試管中混勻，37℃孵育30 min。洗滌后向細(xì)胞混懸液的試管中分別加入抗Pan Ig-FITC，4℃避光反應(yīng)30 min。洗滌后棄上清并混勻細(xì)胞。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測抗體對凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性，選取經(jīng)染色確認(rèn)的凋亡細(xì)胞群，Log2-平均熒光強(qiáng)度(Mean Fluorescence intensity，MFI)用以代表抗體對凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)上清液所含抗體對HLA及MICA的反應(yīng)性將包被有混合MHC Ⅰ類、Ⅱ類抗原及MICA的混合微球懸液(Mixed beads)加入V型底96孔檢測板，每孔5 μl，挑選出對凋亡細(xì)胞反應(yīng)陽性的B細(xì)胞培養(yǎng)上清液20 μl分別加入各孔，水平搖床避光混勻30 min。洗滌2次后向反應(yīng)體系加入IgM-PE二抗，水平搖床避光混勻30 min。洗滌兩次后棄上清，加入80 μl PBS緩沖液充分混勻后，應(yīng)用Luminex 200檢測儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液對HLA及MICA的反應(yīng)性，MFI>1000被定義為陽性反應(yīng)。選取Mixed beads檢測陽性的B細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別應(yīng)用HLA Class I regular beads(主要為人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要含天然HLA抗原)及酸處理過的Class I beads(使隱蔽抗原暴露)檢測患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中所包含的HLA抗體。

2結(jié)果

2.1永生化B淋巴細(xì)胞克隆所分泌抗體對HLA抗原的反應(yīng)性

本研究中，通過B淋巴細(xì)胞體外永生化，我們共獲得107個B細(xì)胞克隆，通過檢測發(fā)現(xiàn)每個B細(xì)胞克隆在體外培養(yǎng)過程中均分泌抗體。Luminex Mixed Beads檢測發(fā)現(xiàn)其中有4個細(xì)胞克隆(編號分別為2B4、2D9、4G4、4G10)分泌的抗體能夠與HLA I類抗原發(fā)生反應(yīng)。為進(jìn)一步鑒定這些抗體具體可以與哪些HLA I類抗原反應(yīng)，我們分別將三種不同的HLA I類抗原微球用于下一步實(shí)驗(yàn)：HLA Class I regular beads(主要為人工合成HLA抗原)、Class I iBEADS(主要為天然HLA抗原)及酸處理過的Class I beads(使隱蔽抗原暴露)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：4個不同的B淋巴細(xì)胞集落分泌的抗體可同時與多種HLA I類抗原反應(yīng)。具體檢測結(jié)果見圖1。

2B4：此抗體主要與三種微球的HLA-B、HLA-C抗原反應(yīng)。反應(yīng)性最強(qiáng)的為酸處理微球B*27:05及B*27:08抗原，這兩種抗原共用抗原決定簇5011。但抗體2B4所識別的其他多種HLA抗原并不共用相同的抗原決定簇。同時，此抗體還與包被于iBEADS上的多種Cw抗原發(fā)生反應(yīng)，這些Cw抗原共用抗原決定簇69R。

2D9：此抗體主要與包被于regular beads上的Regular single antigen beads(人工合成抗原)用紅色柱狀圖(中粗線)表示，iBEADS(天然抗原)用藍(lán)色柱狀圖(深色粗線)表示，酸處理過的Regular single antigen beads(隱蔽抗原)用綠色柱狀圖(細(xì)線)表示。柱狀圖高度分別代表抗體對HLA I類抗原分子的反應(yīng)強(qiáng)度(MFI)。

圖1B細(xì)胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10所分泌的抗體分別對HLA I類抗原分子的反應(yīng)性

HLA-A及HLA-C抗原發(fā)生反應(yīng)。但這些抗原并無共用的抗原決定簇。同時此抗體還與包被于iBEADS上的抗原A23、A24及A29發(fā)生反應(yīng)，但這幾種抗原也無共用的抗原決定簇。此外，抗體2D9也可與包被于酸處理beads上的諸多抗原反應(yīng)，而這些抗原之間也并無共用的抗原決定簇。

4G4：此抗原與包被于regular beads上的抗原C*06:02反應(yīng)性最強(qiáng)，同時與多種HLA-B及HLA-C抗原發(fā)生反應(yīng)，而這些抗原無共用的抗原決定簇。此抗原與包被于iBEADS上的抗原A69、B44、Cw2、Cw4、Cw5、Cw7、Cw12等發(fā)生反應(yīng)，這些抗原之間亦無共用的抗原決定簇。同時，抗體4G4能夠與多種包被于酸處理微球上的諸多HLA-A、HLA-B及HLA-C抗原反應(yīng)，而這些抗原也無共用抗原決定簇。

4G10：與2B4、2D9、4G4抗體不同，此抗體可以與包被于regular beads及酸處理beads上的大多數(shù)HLA-B及HLA-C抗原發(fā)生反應(yīng)，但與包被于iBEADS上的抗原不發(fā)生反應(yīng)。以上諸多抗原中并無共用抗原決定簇。

2.2永生化B淋巴細(xì)胞克隆所分泌抗體對凋亡細(xì)胞的反應(yīng)性

自然抗體是一類未經(jīng)免疫致敏而廣泛存在于人類血清中的抗體，自然抗體由于能夠與抗原決定簇毫不相關(guān)的多種抗原發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)出多反應(yīng)性的特點(diǎn)。而自然抗體的重要特性之一是能夠與凋亡細(xì)胞結(jié)合。因此在本研究中，我們分別檢測了HLA陽性抗體2B4、2D9、4G4、4G10這4種單克隆抗體能否與凋亡細(xì)胞結(jié)合，從而揭示其多反應(yīng)性。結(jié)果顯示，與陰性抗體3D4克隆對照，這四種多反應(yīng)性抗體均能夠與凋亡細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖2)，說明這四種HLA陽性的單克隆抗體同時也是多反應(yīng)性抗體。

3討論

抗體做為一個重要因素廣泛參與實(shí)體器官移植受者對移植物的急性及慢性排異反應(yīng)。在ABO血型相容的供受者匹配中，器官移植致敏后產(chǎn)生的抗體主要為特異性抗供者HLA抗體，然而在研究中發(fā)現(xiàn)，腎移植患者血清中亦可檢測出大量的非供體特異性的HLA抗體(NDSA)[1-4]，在無特異性免疫致敏的前提下，NDSA產(chǎn)生的原因尚不完全明確。目前普遍接受的解釋為交叉反應(yīng)原理[9-12]。即由于多種HLA之間存在共用的抗原決定簇，故腎移植患者血清中產(chǎn)生DSA的同時也可以與供者相似的HLA抗原發(fā)生反應(yīng)，從而表現(xiàn)為NDSA的出現(xiàn)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，腎移植患者在沒有產(chǎn)生DSA的Anti-Fas誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞后，應(yīng)用Annexin V及7-AAD區(qū)分凋亡細(xì)胞與非凋亡細(xì)胞。非多反應(yīng)性B細(xì)胞克隆3D4分泌的抗體做為陰性對照。

圖2多反應(yīng)性B細(xì)胞克隆2B4、2D9、4G4、4G10分泌的抗體與誘導(dǎo)凋亡后的Jurkat細(xì)胞的反應(yīng)性

情況下也可產(chǎn)生NDSA，腎移植術(shù)后NDSA出現(xiàn)的平均中位時間甚至早于DSA[9]。顯然交叉反應(yīng)理論不能完全解釋這種現(xiàn)象。

我們通過研究發(fā)現(xiàn)，多反應(yīng)性抗體2B4、2D9、4G4、4G10同時也能夠與多種HLA抗原發(fā)生反應(yīng)。本研究從單克隆抗體水平，首次應(yīng)用三種不同特征的HLA I類抗原包被的微球同時檢測克隆2B4、2D9、4G4、4G10對HLA抗原的反應(yīng)性。這三類微球的特點(diǎn)分別為：HLA Class I regular beads主要含人工合成HLA抗原，Class I iBEADS主要為天然HLA抗原，酸處理過的Class I beads將天然構(gòu)象中的隱蔽HLA抗原暴露出來。我們通過檢測發(fā)現(xiàn)，無論應(yīng)用哪種檢測方法，這4種抗體均可以與多種HLA抗原反生反應(yīng)，而絕大多數(shù)HLA抗原之間并不共用相同的抗原決定簇，由此充分說明，本研究發(fā)現(xiàn)的單克隆多反應(yīng)性抗體，是基于它們的多反應(yīng)性從而與多種HLA抗原發(fā)生反應(yīng)，而并非完全由于與相同或相似的抗原決定簇發(fā)生反應(yīng)從而表現(xiàn)為與多種HLA發(fā)生的交叉反應(yīng)。因此，本研究從單克隆細(xì)胞、抗體水平揭示了多反應(yīng)性抗體的存在與HLA抗體的相關(guān)性，在交叉反應(yīng)理論之外，為HLA抗體尤其是非供體特異性抗體的產(chǎn)生原因提供了理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The accociation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients

RONGChun-shu1,WANGWei-gang2,LIANXin2,etal.

(1.TheAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China;2.UrologyCenter,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal antibody level,to explore whether the generation of HLA antibodies could be attributed to polyreactive antibodies partially.MethodsB cell were isolated form PBMC of transplant recipients and explanted kidney allograft respectively,then monoclonal B cell clones were obtained through in vitro culture.The reactivity of antibodies secreted by B cell clones to HLA antigens and apoptotic cells was assessed.Results107 B cell clones were generated,all B cell clones have the capacity of secreting antibodies.The monoclonal antibodies secreted from four B cell clones could react to multiple HLA molecules but did not appear to target canonical “shared” epitopes.Further investigation showed that these antibodies reacted to apoptotic cells thereby revealed polyreactivity.Conclusion Our studies revealed the correlation between serum polyreactive antibodies and HLA antibodies in kidney transplant recipients at monoclonal cells and antibodies,and provided experimental basis for the explanation of generation of non-donor specific antibodies besides the cross reactivity theory.

Key words:Kidney transplantation;Polyreactive antibodies;HLA antibodies;Apoptosis

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目81501381；吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目20160101100JC;吉林省衛(wèi)生計(jì)生青年課題項(xiàng)目2015Q004

文章編號：1007-4287(2016)05-0703-04

中圖分類號：R392.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：榮春書，35歲，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)免疫。

(收稿日期：2016-01-15)