無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)對大鼠急性腦缺血的影響

常莉莎，張云鶴，彭延波，張　江*，王大力

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)二科;2.神經(jīng)外科，河北 唐山063000)

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*通訊作者

無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)對大鼠急性腦缺血的影響

常莉莎1，張云鶴2，彭延波1，張江1*，王大力1

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)二科;2.神經(jīng)外科，河北 唐山063000)

摘要：目的探討無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)對大鼠急性腦缺血的保護(hù)作用及機(jī)制。方法54只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組18只：假手術(shù)組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)組(RPC組)，比較3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦含水量、腦梗死體積、海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和凋亡細(xì)胞水平。結(jié)果與I/R組比較，RPC組腦缺血再灌注損傷減輕，神經(jīng)缺損評分降低，腦含水量減少，腦梗死體積減小，錐體細(xì)胞損傷明顯減輕，退變神經(jīng)元明顯減少，凋亡水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)在缺血性腦血管病急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：腦缺血；肢體缺血后適應(yīng)；凋亡；無創(chuàng)性

(ChinJLabDiagn,2016,20:0700)

由于遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)可以通過對肢體等不重要部位進(jìn)行干預(yù)，具有事后性，具有較好的臨床應(yīng)用前景，成為近年研究的熱點。已有研究表明遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)能對心肌[1]、腎臟[2]、骨骼肌[3]及腦[4]產(chǎn)生缺血保護(hù)作用，但尚無定論。本文通過制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)線栓模型，初步探討無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)(remote ischemic postconditioning，RPC)是否對大鼠急性期腦缺血損傷具有保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

主要試劑：Hs-CRP多克隆抗體，購自北京博奧森生物有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自北京博奧森生物有限公司；多聚甲醛，購自天津市奧淇醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司；10%水和氯醛，購自天津歐博凱化工有限公司。

1.2實驗動物及分組

SPF級成年健康雄性SD大鼠54只，體重260-280 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物使用許可證編號：SCXK(京)2009-0004。采用抽簽法將大鼠隨機(jī)分為3組，每組18只：(1)假手術(shù)組(sham組)：單純暴露頸部血管，不行缺血操作，不給予后適應(yīng)干預(yù)。(2)缺血2 h再灌注組(I/R組)：大鼠MCAO 2 h進(jìn)行長時間再灌注。(3)無創(chuàng)性肢體缺血后適應(yīng)組(RPC)：大鼠MCAO 2 h后于魚線拔出的同時立即給予無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型制作對Longa線栓法[5]進(jìn)行改良建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。判定模型：動物麻藥失效蘇醒后出現(xiàn)Horner征(缺血側(cè)出現(xiàn)眼瞼閉合、同側(cè)眼球下陷等)和左側(cè)肢體癱瘓的癥狀。死亡動物及造模不成功的大鼠重新造模保證每組大鼠數(shù)量不變。

1.3.2無創(chuàng)性肢體缺血后適應(yīng)干預(yù)方法用止血帶結(jié)扎大鼠雙側(cè)下肢根部結(jié)扎10 min、放松10 min，進(jìn)行3個循環(huán)，以不能觸摸到股動脈搏動為結(jié)扎股動脈缺血成功。

1.4觀測指標(biāo)

3組大鼠于MCAO模型建立后缺血2 h再灌注24 h后按Zea-Longa[5]等級評分法行神經(jīng)功能評分，然后處死大鼠，采用TUNEL法測凋亡細(xì)胞水平，干濕稱重法檢測腦含水量，HE染色光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，TTC染色法、數(shù)碼相機(jī)拍照、Adobe PhotoShop CS軟件分析、計算腦梗死體積。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.13組大鼠神經(jīng)功能缺損的比較Sham組未見到神經(jīng)功能受損，I/R組與Sham組組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RPC組與I/R組比較，評分降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1　3組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較±s)

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.23組大鼠局灶性腦缺血后腦水含量的比較局灶性腦缺血再灌注后I/R組和RPC組腦組織的含水量較Sham組都明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但與I/R組比較，RPC組腦組織的水含量明顯少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2　3組大鼠腦缺血再灌注后腦水含量的比較±s)

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.33組大鼠局灶性腦缺血后梗死體積的比較Sham組的腦梗死體積為0，與I/R組的腦梗死體積比較，RPC組腦梗死體積減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2　3組大鼠TTC染色腦梗死體積的比較

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.43組大鼠HE染色法光鏡下海馬CA1區(qū)細(xì)胞退變神經(jīng)元數(shù)量的比較與Sham組比較I/R組的退變神經(jīng)元數(shù)量最多，RPC組與I/R組比較，錐體細(xì)胞損傷明顯減輕，退變神經(jīng)元數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4　　　3組大鼠HE染色海馬CA1區(qū)細(xì)胞退變神經(jīng)元數(shù)的

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

2.53組大鼠TUNEL法檢測海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量的比較與Sham組比較，I/R組的凋亡細(xì)胞陽性數(shù)量最多，RPC組與I/R組比較，凋亡細(xì)胞陽性數(shù)量減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5　　　3組大鼠TUNEL法檢測海馬CAI區(qū)神經(jīng)元凋亡的

注：與Sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，*P<0.05。

3討論

已有研究證實缺血后適應(yīng)[6]也能產(chǎn)生缺血耐受，但要使已缺血區(qū)域的腦組織原位再缺血來觸發(fā)缺血后適應(yīng)，臨床應(yīng)用顯然不現(xiàn)實。尤其是大腦對缺血的敏感性及神經(jīng)系統(tǒng)缺血后不可逆的損傷，患者難以接受，臨床醫(yī)生難以操作，使得腦組織原位缺血后適應(yīng)的研究不能用于臨床。遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)[7]是指器官缺血后，對遠(yuǎn)隔器官進(jìn)行短暫的輕度的缺血再通，可起到保護(hù)作用。四肢由于對缺血耐受性強(qiáng)，容易實施缺血適應(yīng)操作，對四肢進(jìn)行短暫缺血再灌注[12]來探討對腦缺血保護(hù)是一種比較安全有效的治療措施?；诖宋覀兺ㄟ^無創(chuàng)性間斷性阻斷大鼠雙側(cè)股動脈缺血刺激，觀察無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)是否能夠增強(qiáng)腦對缺血再灌注損傷的抵抗能力，為臨床救治缺血性腦血管病提供新的思路和手段。

由于SD大鼠腦血管解剖和生理功能與人類高度相似，所以我們在實驗中利用Longa改良線栓法建立了穩(wěn)定的大鼠大腦中動脈模型。采用無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)(止血帶短暫阻斷雙側(cè)下肢血流10 min/10 min、3個循環(huán))的方法進(jìn)行研究，3組大鼠均于再灌注后24 h處死，從神經(jīng)行為學(xué)、腦水腫程度、HE染色病理改變、神經(jīng)元凋亡水平及炎癥反應(yīng)等方面進(jìn)行了研究比較。目前關(guān)于此方面的研究尚存有爭議，如2007年，Zhao等[8]研究認(rèn)為缺血后適應(yīng)可以保護(hù)全腦缺血動物海馬CAI區(qū)的神經(jīng)元，但不能改善其神經(jīng)行為學(xué)測試情況，并說明盡管梗死體積減少但并不意味著神經(jīng)功能改善。但王貝娜等[9]采用短暫肢體缺血后適應(yīng)，發(fā)現(xiàn)可以顯著改善神經(jīng)功能。同期，王麗華等[10]對遠(yuǎn)程缺血后適應(yīng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)NIHSS評分明顯改善。我們的研究證實了無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組與缺血再灌注組比較可以明顯減少腦缺血側(cè)腦梗死體積，減輕腦水腫，同時改善神經(jīng)功能評分，對急性腦缺血具有保護(hù)作用。關(guān)于其腦保護(hù)作用的機(jī)制我們從凋亡方面進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程。Zhao等[8]在大鼠局灶性缺血模型中，發(fā)現(xiàn)缺血后處理能顯著減少缺血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)量。Xing等[11]發(fā)現(xiàn)缺血后適應(yīng)通過抑制凋亡，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血再灌注損傷。我們在實驗中通過HE染色發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元均失去正常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列松散，結(jié)構(gòu)紊亂，錐體細(xì)胞明顯減少，可觀察到大量退變神經(jīng)元。而無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組與之比較凋亡細(xì)胞數(shù)減少，程度有所減輕。同時通過TUNEL染色發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元錐體細(xì)胞發(fā)生萎縮、結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞漿出現(xiàn)深染、空泡損害，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂、溶解，可見到典型的凋亡小體。而無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)組與之比較神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度均明顯減輕，凋亡神經(jīng)元數(shù)也顯著降低。提示無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔缺血后適應(yīng)通過抑制神經(jīng)元凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本實驗證實了無創(chuàng)性遠(yuǎn)隔肢體缺血后適應(yīng)在缺血性腦血管病急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低凋亡水平來實現(xiàn)的。由于其實施具有無創(chuàng)、易行、易接受性的優(yōu)點，更容易實現(xiàn)基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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Noninvasive limb ischemic remote postconditioning effects on acute cerebral ischemia in rats

CHANGLi-sha,ZHANGYun-he,PENGYan-bo,etal.

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospitalofNeurologyIIWardandNeurosurgery,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on acute cerebral ischemia in rats noninvasive limb ischemic remote post.Methods54 male SD rats were randomly divided into 3 groups,18 rats in each group.Sham operation group(Sham group),ischemia reperfusion group (I/R group)and distant limb ischemic postconditioning group(RPC group).Comparison of 3 groups of rats neural function deficit score,cerebral water content,the volume of cerebral infarction,CA1 area of hippocampus cell morphological changes and cell apoptosis level.ResultsCompared with I/R group,RPC group,cerebral ischemia reperfusion injury is reduced,nerve deficit score decreased,the brain water content and reduce the volume of cerebral infarction,reduce the damage of pyramidal cells,degeneration of neurons decreased significantly,lower level of apoptosis.The difference was statistically significant.(P<0.05).ConclusionNoninvasive limb ischemic remote postconditioning has neuroprotective effects on ischemic cerebrovascular disease at acute stage.The mechanism is probably by decreasing the level of apoptosis of neural cells to achieve.

Key words:cerebral ischemia;limb ischemic postconditioning;apoptosis;noninvasive

文章編號：1007-4287(2016)05-0700-04

中圖分類號：R743.32

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：常莉莎(1975-)，女，博士研究生，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：腦血管疾病。

(收稿日期：2015-06-15)