分枝桿菌胞外聚合物EPS對芘增溶作用的影響

谷玥+賈春云+劉志紅+卜寧+方玥蒙

摘要：為闡明分枝桿菌胞外聚合物（EPS）在土壤多環(huán)芳烴（PAHs）微生物修復(fù)過程中的作用機(jī)理，以芘為研究對象，研究在不同pH值、溫度和EPS濃度條件下，EPS對芘增溶作用的影響。結(jié)果表明：在固定EPS濃度下，48 h內(nèi)芘在EPS中的溶解量先增高后降低，于8 h芘溶解度達(dá)到最大值，為0.368 mg/L；當(dāng)溫度升高時（15～35 ℃），EPS濃度從65.2 mg/L增加到422.6 mg/L，芘溶解量的變化趨勢均為先升高后降低，在25 ℃、216.3 mg/L條件下，芘溶解量達(dá)到最大值；隨著pH值升高（pH值范圍為1～9），芘的溶解量先升高后降低，于pH值=5（自然）時溶解量最多。研究證實(shí)了EPS能夠促進(jìn)芘的溶解，通過芘的溶解量受溫度、EPS濃度及pH值影響而變化的研究，推測EPS增溶芘的作用過程，其中影響芘溶解的主要物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

關(guān)鍵詞：胞外聚合物（EPS）；分枝桿菌；芘；pH值；溫度；增溶

中圖分類號： S182；X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0445-03

多環(huán)芳烴是一類由多個苯環(huán)構(gòu)成的持久性有機(jī)污染物，其“三致”（致突變、致癌、致畸）效應(yīng)給生態(tài)環(huán)境、人類健康都會帶來極大危害。基于多環(huán)芳烴廣泛存在于環(huán)境中，多環(huán)芳烴的環(huán)境修復(fù)一直是研究熱點(diǎn)，土壤作為一種重要的環(huán)境介質(zhì)，其中的多環(huán)芳烴是空氣中與水中多環(huán)芳烴的匯集源，因此土壤中多環(huán)芳烴的修復(fù)更是研究重點(diǎn)，但是多環(huán)芳烴在土壤中通常會發(fā)生老化，從而給修復(fù)帶來很大的困難。通常土壤中多環(huán)芳烴的苯環(huán)數(shù)在2～3個時為低分子量多環(huán)芳烴，污染的土壤較易修復(fù)；而當(dāng)多環(huán)芳烴分子中苯環(huán)數(shù)≥4個時，為高分子量多環(huán)芳烴，污染的土壤較難修復(fù)[1-2]。芘作為高分子量多環(huán)芳烴中最典型的一種，是很多多環(huán)芳烴環(huán)境修復(fù)的研究對象，而在眾多修復(fù)技術(shù)中，微生物修復(fù)因其高效、針對性強(qiáng)等特點(diǎn)，是目前較為熱門的修復(fù)技術(shù)。陸泗進(jìn)等從土壤中分離純化出2株芘的高效降解菌，并探討了菌株在土壤環(huán)境中對芘的降解情況[3]；李曉明等篩選馴化出可以降解芘的高效菌群，為多環(huán)芳烴的生物修復(fù)奠定了理論基礎(chǔ)[4]。

微生物胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）是一種附著于細(xì)菌表層的有機(jī)高分子多聚化合物，主要由蛋白質(zhì)、多糖、DNA和腐殖酸四大類物質(zhì)構(gòu)成，是微生物細(xì)胞外極其重要的組成部分，可以協(xié)助細(xì)胞攝入附近的營養(yǎng)物，對微生物的生長繁殖起重要作用[5-7]，因微生物修復(fù)技術(shù)被廣泛應(yīng)用，EPS也成為微生物修復(fù)研究中的重要方面：如在重金屬吸附方面，簡磊等通過試驗(yàn)研究了EPS吸附重金屬離子的作用機(jī)理、影響EPS吸附重金屬的因素，以及EPS對鉛銅等重金屬的吸附特性[8]。在有機(jī)污染物降解方面，楊智臨等將EPS與萘、菲的專一降解菌分別聯(lián)用，萘降解率達(dá)96%，菲降解率達(dá)100%[9]。姜春陽等研究發(fā)現(xiàn)，真菌、細(xì)菌的EPS具有較強(qiáng)的降解土壤中芘的能力，且EPS濃度越高，土壤中芘的降解效果越好[10]。EPS能自發(fā)通過范德華力或乳化作用與水體中有機(jī)污染物作用促進(jìn)污染物的降解[11-13]。Zheng等研究發(fā)現(xiàn)，從原油污染土壤中分離出2株可以產(chǎn)生PAHs乳化劑EPS的菌株[14]。因此，EPS在微生物降解芘反應(yīng)過程中的作用十分重要，但是針對其在具體反應(yīng)過程中的機(jī)制研究還尚顯不足，本研究以EPS濃度、pH值、以及溫度作為變量，研究3種因素在不同條件下EPS對溶液中芘溶解作用的影響，探究分枝桿菌EPS增溶芘的最適條件，并借以發(fā)現(xiàn)可能的反應(yīng)機(jī)制及反應(yīng)中的關(guān)鍵反應(yīng)物質(zhì)，以期為后續(xù)利用分枝桿菌進(jìn)行土壤中污染物的微生物降解奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑 主要儀器為：高速離心機(jī)（IECMultiRF，美國）；空氣恒溫振蕩器（HZQ-C，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；高效液相色譜儀（1200系列，美國安捷倫科技公司）；總有機(jī)碳測定儀（multi N/C3100，德國耶拿）；萬分之一天平；0.45 μm水相濾器；0.22 μm有機(jī)相濾器。主要試劑為：芘（德國Fluka公司，純度>97%）；丙酮（分析純，沈陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠）；二氯甲烷（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)總公司化工廠）。

1.1.2 菌種 分枝桿菌（Mycobacterium sp.），對芘的降解率為85.5%，由中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所土壤污染生態(tài)組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芘儲備溶液的配制 使用萬分之一天平精確稱取0.050 g 芘，溶于40 mL丙酮，移入50 mL容量瓶中，加丙酮定容，精確配制成1 mg/mL芘的丙酮儲備溶液。

1.2.2 制備EPS

1.2.2.1 菌種培養(yǎng) 稱取3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl，溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，配制成1 L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液，分裝入錐形瓶內(nèi)，121 ℃滅菌 30 min。將菌株接入培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃、135 r/min培養(yǎng) 7 d。

1.2.2.2 EPS提取與有機(jī)碳測定 改進(jìn)張宇等的方法[15]，取菌體生長7 d的培養(yǎng)液于8 000 r/min離心4 min，棄上清液；補(bǔ)充無菌水至原體積，于8 000 r/min離心4 min，去上清液；加入適當(dāng)無菌水（不同量無菌水制備不同濃度的EPS）制備成菌懸液。將該菌懸液放入60 ℃水浴鍋中加熱30 min。將樣品于 12 000 r/min 離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾，得到的無色透明溶液即為EPS樣品，加入0.1 mg/L NaN3作為抑菌劑。用總有機(jī)碳測定儀（TOC）測定EPS中有機(jī)碳含量。

1.2.3 芘的增溶試驗(yàn)

1.2.3.1 EPS對芘增溶效果的影響 取0.2 mL芘的儲備溶液于三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后，加入10 mL TOC濃度為264.3 mg/L的EPS溶液。對照組加10 mL水，套上無菌膜，用牛皮紙密封，置于25 ℃、180 r/min搖床中振蕩。分別于1、2、4、6、8、12、24、36、48 h定時取樣。每組試驗(yàn)設(shè)3組平行。

1.2.3.2 溫度、EPS濃度對芘增溶效果的影響 取0.2 mL芘的丙酮溶液于三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后，分別加入10 mL TOC濃度為65.2、167.1、216.3、346.6、422.6 mg/L的1、2、3、4、5號EPS溶液。在對照組0號中加入10 mL無菌水，套上無菌膜，用牛皮紙密封，置于25 ℃、180 r/min的搖床中振蕩8 h后取樣。每組試驗(yàn)設(shè)置3組平行。

重復(fù)上述步驟，置于15、35 ℃條件下。

1.2.3.3 pH值對芘增溶效果的影響 取0.2 mL芘的丙酮溶液于三角瓶中，待丙酮揮發(fā)完全后，分別加入10 mL TOC濃度為178.6 mg/L、pH值為1、3、5、7、9的EPS溶液，在對照組中加入10 mL pH值為1、3、5、7、9的無菌水，套上無菌膜，用牛皮紙密封，置于25 ℃、180 r/min的搖床振蕩8 h后取樣。每組試驗(yàn)設(shè)置3組平行。

1.2.4 芘的提取與測定

1.2.4.1 溶液中芘的提取 采用液相萃取法，首先將三角瓶中溶液過0.45 μm水相濾器，然后向?yàn)V后溶液中加入等體積的二氯甲烷，放入振蕩器中振蕩5 min（25 ℃、180 r/min），全部移入50 mL分液漏斗中，靜置5 min，分層后將下層有機(jī)相存入燒杯中，每個樣品按此步驟重復(fù)萃取3次。將3次萃取液混勻，轉(zhuǎn)移至燒杯中，使用普通氮?dú)獯抵两?，最后用甲醇定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜后移入液相色譜專用進(jìn)樣瓶中。

1.2.4.2 芘的測定 采用高效液相色譜法，色譜儀主要設(shè)定參數(shù)為：流動相：100%甲醇；流速：0.8 mL/min；VWD檢測波長：254 nm；柱箱溫度：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[16]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Sigmaplot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPS對芘增溶效果的影響

由圖1可以看出，在1～48 h的9個測試點(diǎn)上，芘在EPS中的溶解量與各自對照組（芘在水中的溶解量）相比均有顯著差別（P<0.05）：芘在EPS中的溶解量隨著溶液與芘作用時間的變化呈現(xiàn)先增高而后降低的趨勢，在1～8 h時，芘在EPS中的平均溶解量由0.293 mg/L增加到0.368 mg/L，與對照組比較，增溶量由79.9%上升至120.2%，呈明顯上升趨勢，在8 h時達(dá)最大值；但在8～48 h，隨著培養(yǎng)時間的延長，芘的平均溶解量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，與對照組比較，增溶量由120.2%降為45.0%以下，呈下降趨勢，這可能與EPS中蛋白質(zhì)失活有關(guān)。經(jīng)SPSS計(jì)算分析可知：對照組中芘溶解量平均值為0.179 mg/L，EPS處理組中芘溶解量平均值為 0.318 mg/L，水處理組與EPS處理組間差異顯著，與對照相比，芘在EPS處理組中的增溶達(dá)到77.65%。但對對照組與EPS處理組進(jìn)行單因素方差分析可知，測試點(diǎn)間數(shù)據(jù)不成線性關(guān)系假設(shè)。

2.2 溫度、濃度對芘增溶效果的影響

由圖2可以看出，溫度的升高可以增加芘的溶解量。0號水處理中，35 ℃與15、25 ℃比，芘溶解量略有增加；1號EPS處理組中，芘在水中的溶解量隨溫度升高而增加；2號EPS處理組中，15、25 ℃時芘的溶解量差異小，在35 ℃時芘的溶解量有所增加；3號EPS處理組中，25 ℃條件下芘的溶解量最高，35 ℃次之，15 ℃溶解量最低；4號EPS處理組中，芘的溶解量大小同樣是25 ℃>35 ℃>15 ℃；5號EPS處理組中，芘的溶解量排序則是35 ℃>25 ℃>15 ℃。

在溫度相同、EPS濃度不同的情況下，芘的增溶效果也不同：在15、35 ℃，隨著EPS濃度的增加，芘的溶解量有所提高：TOC含量為422.6 mg/L的5號組芘溶解量分別達(dá)到0.197、0.255 mg/L；而在25 ℃，芘的溶解量隨EPS濃度的增大先增高后降低，于TOC含量為263.3 mg/L時（3號組）溶解量最大，為0.303 mg/L，與相同溫度下水處理芘溶解量相比，增溶率達(dá)97.3%。

2.3 pH值對芘增溶效果的影響

在不同pH值條件下，水、EPS組芘溶解量見圖3?？梢钥闯?，pH值相同時，不同處理對芘的溶解量有較大影響：pH值=1、3時，芘在EPS處理組與水處理組溶解量差異不大；pH值=5時，芘的溶解量在2組中有明顯差別：EPS處理組的溶解量增加到0.274 mg/L，遠(yuǎn)高于水組的0.163 mg/L，增溶率達(dá)到68.1%；pH值=7時，EPS處理組芘的溶解量只是略高于水組；pH值=9時，水處理與EPS處理芘溶解量幾乎相等。溶劑相同、pH值不同時，水處理組pH值改變對芘溶解量的影響無差異，EPS處理組pH值改變對芘溶解量的影響差異很大，pH值=5時，芘的溶解量最大。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

EPS是細(xì)菌分泌到細(xì)胞周圍所有物質(zhì)的總稱，主要包括多糖、蛋白質(zhì)、腐殖酸及少量核酸，有研究表明，細(xì)菌分泌的胞外蛋白作為細(xì)菌與外界的“通道”，攝入外來物質(zhì)；分泌的胞外多糖起到對物質(zhì)的吸附和絮凝作用，而腐殖酸可以與有機(jī)物產(chǎn)生吸附和配合作用，形成大分子絡(luò)合物[17-20]。這幾種物質(zhì)所構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)模式對細(xì)菌攝入污染物起著復(fù)雜的作用：EPS與生物體間發(fā)生離子架橋、靜電中和等反應(yīng)所表現(xiàn)出的黏結(jié)性，有利于對多環(huán)芳烴的溶解吸附，提高細(xì)菌對多環(huán)芳烴的去除能力[21-22]，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。EPS中多種有機(jī)官能團(tuán)在溶液中離子化所表現(xiàn)出表面負(fù)電荷性，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)-多糖反應(yīng)、疏水反應(yīng)、氫鍵、離子反應(yīng)的發(fā)生[23]，進(jìn)而可以增強(qiáng)EPS與芘的相互作用，增加芘的溶解量。

多環(huán)芳烴的的溶解量可能還與所使用溶劑的親水疏水性有關(guān)。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)：EPS對多環(huán)芳烴的增溶主要靠松散層胞外聚合物的多糖部分[24]；劉虹等在糖脂類生物表面活性劑對石油烴的增溶研究中發(fā)現(xiàn)：石油烴的溶解度隨糖脂類生物表面活性劑濃度的增加而增加[25]；趙東維研究發(fā)現(xiàn)，糖脂類表面活性劑對多環(huán)芳烴的增溶作用隨pH值的增大而增強(qiáng)[26]。這些試驗(yàn)均與本試驗(yàn)結(jié)果有差異，說明EPS中起增溶作用的物質(zhì)不單是糖類。有研究表明：蛋白質(zhì)、腐殖酸是EPS中疏水部分的主要物質(zhì)，而糖類則是親水部分的主要物質(zhì)[27]，因此，EPS對芘的溶解可能是一個較為復(fù)雜的作用過程：首先疏水部分和芘相互作用聚集在內(nèi)部，親水部分包裹在外面與水相溶，隨后二者共同作用，芘在水中的溶解量增加。鑒于蛋白質(zhì)受溫度、pH值的變化而變化[28]，以及芘在分枝桿菌EPS中的溶解度隨EPS濃度、溫度以及pH值的變化而變化的特點(diǎn)，可以推測：EPS內(nèi)的蛋白質(zhì)對芘的增溶有很大影響。

3.2 結(jié)論

（1）EPS溶液能夠增加芘的溶解量，與對照組相比平均提高77.65%。當(dāng)EPS與芘相互作用8 h時，芘的溶解量最高，是對照組的1.2倍。（2）溫度與EPS濃度也是影響芘的溶解量變化的因素，當(dāng)溫度為25 ℃、EPS的TOC濃度為 216.3 mg/L 時，芘的溶解量最大。（3）改變pH值也可以增加芘的溶解量：pH值=5是EPS增溶芘的最佳條件。（4）由于芘的溶解量受溫度、胞外聚合物（EPS）濃度及pH值影響比較大，可以推測：EPS內(nèi)影響芘溶解的主要因素是蛋白質(zhì)。

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