玉米赤霉烯酮對(duì)原代大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)以及氧化應(yīng)激的影響

徐明龍+郭保平+胡進(jìn)+牛亞茹+肖成+徐銀學(xué)

摘要：研究玉米赤霉烯酮（ZEA）體外對(duì)原代大鼠睪丸支持細(xì)胞（sertoli cell）增殖相關(guān)基因波形蛋白（vimentin）和細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）表達(dá)及對(duì)氧化應(yīng)激中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活力的影響。體外分離培養(yǎng)原代大鼠睪丸支持細(xì)胞，不同濃度的ZEA作用細(xì)胞20 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，熒光定量PCR檢測(cè)Vimentin、CCND1基因mRNA的表達(dá)，Westblot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)，并且檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活力。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，Vimentin、CCND1 mRNA表達(dá)量都隨著ZEA濃度的升高而降低，但是Vimentin蛋白表達(dá)量卻沒(méi)有明顯變化，CCND1蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量一致。SOD活性、GSH-PX活性均隨著ZEA濃度的升高呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。結(jié)果表明，ZEA對(duì)體外培養(yǎng)大鼠支持細(xì)胞具有生殖毒性作用，影響Vimentin、CCND1的表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)從而使SOD與GSH-PX活性產(chǎn)生變化。

關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮；原代睪丸支持細(xì)胞；波形蛋白；周期蛋白D1；氧化應(yīng)激酶

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0299-05

玉米赤霉烯酮（ZEA）別稱F-2毒素，是由鐮刀菌產(chǎn)生旳一種霉菌毒素，并且是一種類雌激素毒素。ZEA最初于1962年從污染了禾谷鐮刀菌的發(fā)霉玉米中分離得到，1966年正式定名[1-2]。鐮刀菌主要侵害玉米、小麥、燕麥、大麥等作物，產(chǎn)生的ZEA具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性，對(duì)腫瘤發(fā)生也有一定影響，對(duì)人、動(dòng)物健康具有潛在危害，日益受到人們重視。ZEA在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，甚至在人們的食物中也能檢測(cè)到ZEA的存在[3]。睪丸支持細(xì)胞作為生精細(xì)胞的支架，能夠分泌雄激素結(jié)合蛋白以及產(chǎn)生類固醇類，為生精細(xì)胞提供充足的雄性激素和必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還能保證血睪屏障和體內(nèi)微循環(huán)、精子的發(fā)育和成熟，從而調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)的功能[4]。所以，支持細(xì)胞受到損傷會(huì)直接影響精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞失去發(fā)育和成熟的營(yíng)養(yǎng)保證，導(dǎo)致各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞核模糊、細(xì)胞器減少等[5]，從而使雄性生殖系統(tǒng)出現(xiàn)問(wèn)題，精子活力、數(shù)目出現(xiàn)異常，導(dǎo)致雄性不育不孕。由此可見(jiàn)，睪丸支持細(xì)胞是研究雄性生殖系統(tǒng)毒性的范細(xì)胞。本試驗(yàn)通過(guò)研究ZEA對(duì)體外培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞增殖相關(guān)基因Vimentin、CCND1表達(dá)以及氧化應(yīng)激酶（SOD，GSH-PX）的影響，探討ZEA對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能的毒性作用和機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

24日齡左右的清潔級(jí)雄性SD大鼠（南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)），ZEA（Sigma公司），DMEM/F12培養(yǎng)液，PBS緩沖液（Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），膠原酶I（MP Biomedicals），胎牛血清（Gibco公司），Tris-HCl（Sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），Real-time PCR Master Mix （TaKaRa公司），二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司），TRIzol （TaKaRa公司），SYBR Green Master Mix（Vzayme公司），MTT檢測(cè)試劑盒（杭州碧云天），油紅O染料；超氧化物歧化酶（SOD）；GSH-PX檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液（杭州碧云天公司），寡核苷酸引物由南京金維智有限公司合成。

1.2 原代大鼠睪丸支持細(xì)胞分離和培養(yǎng)[6-7]

采用頸椎脫臼法處死大鼠，將其全身浸泡于消毒乙醇后于無(wú)菌條件下取出睪丸，放入預(yù)冷的PBS中，剝離被膜、血管，隨后PBS液沖洗2次。用眼科剪將曲細(xì)精管剪成約 1 mm3 碎塊，轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中；加入0.25% 胰酶和 0.1% 膠原酶Ⅰ各2 mL，37 ℃ 水浴振蕩消化約30 min（觀察到組織碎塊消化至黏液狀為準(zhǔn)），加入2 mL含有血清的培養(yǎng)基吹打均勻，經(jīng)100 μm篩網(wǎng)過(guò)濾后離心，去除上層清液。PBS洗1次后加入培養(yǎng)基 （DMEM/F12、15%胎牛血清、青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 U/mL），吹打細(xì)胞成細(xì)胞懸液；臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為 3×105～5×105個(gè)/mL，接種于六孔培養(yǎng)板中，置于 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)（95% 空氣和 5% CO2，溫度37 ℃），48 h后加入適量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）處理少許附著生精細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)備用，隔天換液 1 次[8]。

1.3 油紅O染色鑒定支持細(xì)胞[9]

Tris-HCl處理生精細(xì)胞24 h，吸取培養(yǎng)基后用 PBS沖洗1次；加入4%多聚甲酸固定30 min；滴加油紅O染液，室溫染色15～30 min；用濃度為75%的乙醇清洗多余染料；蘇木素復(fù)染10～15 min，滴管吸取水洗至其變?yōu)樗{(lán)色，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、記錄。

1.4 ZEA對(duì)睪丸細(xì)胞的作用

將ZEA溶解于DMSO中，將純化后的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，換含有ZEA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，終濃度為0、 50、 100、 125、 150 μmol/L，DMSO在每組中濃度不超過(guò)0.1%。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性

將“1.2”節(jié)中提取的支持細(xì)胞培養(yǎng)24 h，加入適量 20 mmol/L Tris-HCL （pH值 7.0）處理少許附著生精細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的ZEA（0、 50、 80、 100、 125、 150 μmol/L以及0.1%DMSO）100 μL培養(yǎng)20 h后，加入 20 μmol/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μmol/L DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀D490 nm處測(cè)量各孔的吸光度。設(shè)置調(diào)零空白孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），每個(gè)濃度組至少6個(gè)相同重復(fù)孔。0 μmol/L為標(biāo)準(zhǔn)組，其余濃度為試驗(yàn)組。計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力=D試驗(yàn)-D空白D標(biāo)準(zhǔn)-D空白×100%。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)

將“1.4”節(jié)中用ZEA不同濃度培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)20 h，按照傳統(tǒng)TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，D260 nm/D280 nm值為1.9～2.0，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物-20 ℃保存。引物見(jiàn)表1。定量?jī)x器為StepOne，反應(yīng)體系（20 μL）為：2 μL cDNA 模板，0.4 μL 上游引物，0.4 μL 下游引物，0.4 μL Rox，10 μL Taq MasterMix酶，6.8 μL DEPC水。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。融解曲線條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.7 Westblot檢測(cè)相關(guān)基因蛋白水平的表達(dá)

將“1.4”節(jié)中用ZEA不同濃度培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)20 h，用RIAP裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取總蛋白 15～30 μg 進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%BSA封閉2 h，分別加Vimentin、CCND1（Santa Cruz Biotechnology，1 ∶500 TBST-BSA稀釋）和 β-actin（Cell Signaling Technologies，1 ∶1 000 TBST-BSA稀釋）兔抗鼠抗體，4 ℃ 過(guò)夜，TBST 洗 3次，每次 15 min。加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下反應(yīng)2 h，TBST 洗3次，每次 15 min。ECL 發(fā)光壓片顯色，掃描并分析圖像。

1.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

將“1.4”節(jié)中培養(yǎng)的細(xì)胞上清液收集于2 mL EP管中，SOD檢測(cè)反應(yīng)通過(guò)黃嘌呤以及黃嘌呤氧化物反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)分光光度計(jì)在550 nm處測(cè)其吸光度。SOD計(jì)算公式為：SOD=D對(duì)照組-D測(cè)定組D對(duì)照組×68 U/mL。

將“1.4”節(jié)中培養(yǎng)的細(xì)胞上清液收集于2 mL EP管中，GSH-PX 可以促進(jìn)過(guò)氧化氫（H2O2）與還原性谷胱甘肽反應(yīng)生成H2O以及氧化性谷胱甘肽（GSSG），可用其酶促反應(yīng)速度來(lái)表示谷胱甘肽過(guò)氧化物的活性，測(cè)定此酶促反應(yīng)中還原性谷胱甘肽的消耗，可求出酶活力。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基甲酸陰離子呈現(xiàn)穩(wěn)定的黃色，在 412 nm 處測(cè)定其吸光度。GSH-PX計(jì)算公式為：GSH-PX=D非酶管-D酶管D標(biāo)準(zhǔn)管-D空白管×20×5酶活力單位。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各試驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行多組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油紅O鑒定支持細(xì)胞結(jié)果

如圖1所示，鏡下可見(jiàn)支持細(xì)胞胞體呈寬大的不規(guī)則狀，有粗大的突起，細(xì)胞成簇，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)小吞噬物或小空泡，核大，呈藍(lán)色，卵圓形或不規(guī)則形，核質(zhì)均勻。細(xì)胞質(zhì)中有大小不等的紅色脂滴，此為支持細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一[9]。

2.2 ZEA對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示，純化后的細(xì)胞用ZEA培養(yǎng)20 h，ZEA濃度分別為0、50、 80、100、125、150 μmol/L，電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，可見(jiàn)ZEA濃度為100 μmol/L時(shí)，部分細(xì)胞開始皺縮；當(dāng)ZEA濃度為150 μmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞基本皺縮，漂浮死細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

2.3 ZEA對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞活力的影響

如圖3所示，不同濃度ZEA培養(yǎng)細(xì)胞20 h，采用MTT方法檢測(cè)處理細(xì)胞的活力?？梢钥闯?，隨著ZEA濃度升高，細(xì)胞活力呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，在150 μmol/L濃度下，細(xì)胞活力只有40%左右。0 μmol/L作為空白對(duì)照組，0.1% DMSO作為陰性對(duì)照組。

2.4 增值基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

支持細(xì)胞Vimentin、CCND1基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖4與圖5，原代大鼠睪丸支持細(xì)胞經(jīng)不同濃度ZEA處理后Vimentin、CCND1表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是Vimentin蛋白和mRNA的表達(dá)量趨勢(shì)并不一致。Vimentin蛋白表達(dá)量隨著ZEA濃度的提高并沒(méi)有明顯變化。

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

如圖6、圖7所示，大鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD和GSH-PX檢測(cè)皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。尤其是在高濃度ZEA處理下，不管是SOD還是GSH-PX都具有增加趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

ZEA在結(jié)構(gòu)上與內(nèi)源雌激素17p-雌二醇（E2）相似[10]，在活化ER-受體上的特征相似，能發(fā)揮雌激素樣作用，ZEA與ER受體（雌激素受體）發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，通過(guò)激活雌激素反應(yīng)元件，使雌激素受體發(fā)生二聚化，進(jìn)而發(fā)生一系列的類似雌激素效應(yīng)，擾亂生殖激素的正常分泌，對(duì)動(dòng)物的繁殖機(jī)能造成嚴(yán)重危害，可導(dǎo)致家畜、家禽雌激素水平明顯提高。研究表明，ZEA主要作用于生殖系統(tǒng)，對(duì)雌性動(dòng)物、雄性動(dòng)物都能產(chǎn)生危害。ZEA中毒后，雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)主要表現(xiàn)為乳頭腫大、陰唇紅腫、子宮增大、假孕、不孕、胚胎骨豁發(fā)育畸形、死胎、流產(chǎn)以及出現(xiàn)持續(xù)無(wú)卵性發(fā)情期。雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)主要表現(xiàn)為睪丸萎縮、乳頭腫大、包皮水腫、精液濃度降低、質(zhì)量下降等癥狀以及不同程度損傷的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞[11]。

生精上皮中，能與生精細(xì)胞相接觸的細(xì)胞只有睪丸支持細(xì)胞，同時(shí)它也是生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”。在結(jié)構(gòu)上它對(duì)生精細(xì)胞起到支架作用，促進(jìn)其發(fā)育、成熟，為生精過(guò)程供給不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還能協(xié)調(diào)生精細(xì)胞保證其正常進(jìn)行精子發(fā)育、成熟等過(guò)程[12]。在精曲小管基底部和管腔之間的各級(jí)生精細(xì)胞按照發(fā)育、成熟的程度排列，支持細(xì)胞是提供給管腔外側(cè)生精細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的唯一來(lái)源。為了防止生精細(xì)胞和精母細(xì)胞的抗原與體內(nèi)的抗體相接觸，睪丸支持細(xì)胞之間形成了血睪屏障，從而阻止免疫反應(yīng)產(chǎn)生[12]。

細(xì)胞骨架系統(tǒng)是真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，支持細(xì)胞具有完整和高度組織化的細(xì)胞骨架系統(tǒng)，對(duì)生精細(xì)胞增殖和精子生成具有重要意義。中間纖維是支持細(xì)胞骨架的重要組成部分，主要由波形蛋白（vimentin）組成[13-14]，在細(xì)胞中主要作為結(jié)構(gòu)蛋白起作用[15]。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Vimentin 很快被水解，其裂解是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）或是被該酶激活的一組蛋白酶所介導(dǎo)。睪丸支持細(xì)胞間形成緊密連接，參與形成血睪屏障，Vimentin 在支持細(xì)胞緊密連接中具有重要作用，可能參與血睪屏障功能，對(duì)維持生精上皮的完整性有重要意義，促進(jìn)支持細(xì)胞和生精細(xì)胞間的物質(zhì)和信息交換，精子發(fā)生并支持細(xì)胞功能的發(fā)揮。Vimentin 的降解可使支持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和支持功能受到破壞，導(dǎo)致生精細(xì)胞與生精上皮分離，生殖細(xì)胞凋亡增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著ZEA濃度的增加，Vimentin的mRNA表達(dá)量明顯減少，蛋白水平上各個(gè)濃度卻沒(méi)有明顯變化。由此推測(cè)ZEA隨著濃度的提高刺激細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化從而刺激Vimentin的表達(dá)，在翻譯水平上，可能細(xì)胞通過(guò)別的通路和手段補(bǔ)償性合成Vimentin，在高濃度ZEA的影響下，細(xì)胞活力顯著降低，死細(xì)胞增多，活細(xì)胞雖然形態(tài)發(fā)生變化，可是結(jié)構(gòu)依然存在，在每個(gè)毒素濃度組中蛋白濃度差不多的情況下，Vimentin最終的蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，細(xì)胞還維持著相對(duì)的功能和結(jié)構(gòu)，具體的機(jī)理還有待研究。

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期（G1、S、G2期）與分裂期（M期）2個(gè)階段。1983年，Evans等首次在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)一組蛋白質(zhì)呈周期性出現(xiàn)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此將其確定為細(xì)胞周期蛋白（cyclin），細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）是該基因編碼的蛋白質(zhì)，屬于高度保守的周期蛋白家族，該家族成員的顯著特征是貫穿細(xì)胞周期，其蛋白質(zhì)豐度周期性，急劇改變[16]。周期蛋白作為CDK（周期蛋白依賴性激酶）的調(diào)節(jié)因子，CCND1調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化[17]，生命個(gè)體細(xì)胞周期的關(guān)鍵是G1期的啟動(dòng)，CCND1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，是比其他cyclins更加敏感的指標(biāo)[18]。G1期是細(xì)胞在增殖過(guò)程中能接受從外界傳入的增殖或抑制增殖信號(hào)的唯一時(shí)期，因此研究CCND1對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要。目前，CCND1已被公認(rèn)為是一種原癌基因，其過(guò)度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化[19]。本研究結(jié)果表明，隨著ZEA濃度的升高，CCND基因的mRNA和蛋白表達(dá)量皆顯著降低，可見(jiàn)ZEA嚴(yán)重影響睪丸支持細(xì)胞的增殖，ZEA對(duì)細(xì)胞的毒性明顯，細(xì)胞活性明顯降低，導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡與壞死，抑制CCND1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期變長(zhǎng)，變相導(dǎo)致細(xì)胞死亡加速。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。SOD是源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。SOD幾乎存在于所有生物細(xì)胞中，通過(guò)把 O-2· 轉(zhuǎn)化為 H2O2，H2O2再被過(guò)氧化氫酶和氧化物酶轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水（H2O），從而達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，保護(hù)細(xì)胞的目的。研究表明，對(duì)人體不斷補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果，可以清除超氧陰離子自由基從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷[20-21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著ZEA濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活力顯著增高，說(shuō)明ZEA可以刺激睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用。可能是ZEA高濃度（150 μmol/L）下細(xì)胞破碎裂解嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)的SOD釋放到培養(yǎng)液中，從而使其SOD活力增加，具體的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。GSH-PX是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)含硒酶，在機(jī)體內(nèi)以硒代半胱氨酸（S）的形式發(fā)揮作用，以谷胱甘肽為還原劑分解體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以防止細(xì)胞膜和其他生物組織免受過(guò)氧化損[22] 。GSH-PX的作用是和SOD、過(guò)氧化氫酶（CAT）一起共同構(gòu)成生物體內(nèi)活性氧防御系統(tǒng)。機(jī)體對(duì)活性氧 O-2· 的第一道防線是SOD，它將 O-2· 轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和其他氫過(guò)氧化物；第二道防線是CAT和GSH-PX，其中CAT可清除過(guò)氧體系中的H2O2，GSH-PX分布在細(xì)胞的胞液和線粒體中，可同時(shí)清除H2O2和氫過(guò)氧化物，從而有效地保護(hù)機(jī)體[23]。本研究結(jié)果表明，隨著ZEA濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-PX酶活力顯著增加，證明ZEA能產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用，細(xì)胞分泌更多的GSH-PX來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激帶來(lái)的負(fù)面影響。

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