苯丙氨酸、茉莉酸甲酯對百里香不定芽基礎代謝及精油提取率的影響

李曉東+徐世千+張建國+魯朝輝+于燕

摘要：以離體培養(yǎng)的百里香不定芽為材料，研究添加不同濃度苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）對不定芽生長過程中基礎生理代謝、精油提取率的影響。結(jié)果表明：添加供試濃度Phe、MJ顯著提高了百里香不定芽中可溶性蛋白、可溶性糖含量，其含量隨著Phe、MJ濃度的上升呈先上升后下降的趨勢；適宜濃度的Phe、MJ增強不定芽中SOD、POD、PAL活性，抑制PPO活性，且具有明顯的濃度效應，其中添加100 mg/L Phe、150 mg/L MJ效果最佳。在此基礎上，提取了百里香精油，添加100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ的提取率分別為042%、0.39%，分別比對照（0.31%）高35.5%、25.8%。

關鍵詞：苯丙氨酸；茉莉酸甲酯；百里香；生理代謝；精油提取率

中圖分類號： S567.23+9.01

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0245-05

百里香（Thymus vulgaris L.）是唇形科（Lamiaceae）百里香屬（Thymus）多年生芳香植物，是一種重要的芳香和藥用植物，同時也可作為環(huán)保、觀賞以及蜜源植物，極具開發(fā)價值[1]。百里香植株花莖葉可提取芳香油，百里香精油是重要的天然香料、天然防腐劑以及天然抗氧化劑，具有廣泛的商業(yè)價值[2-4]，其主要成分百里酚、香芹酚可以預防和治療人類疾病[5]；同時百里香提取物還具有化感作用[6-7]，有望成為新型的生物除草劑。百里香精油的市場需求日益增大，但是野生百里香資源有限，而且栽培百里香的生長周期長且提取率很低。因此，人們開始嘗試利用各種途徑提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，其中刺激劑的利用是最有效的方法之一。

苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是植物必需的一種氨基酸，它可以作為碳源以及通過參與蛋白質(zhì)的合成來影響植物的生長發(fā)育；同時，在植物細胞的次生代謝中，苯丙氨酸還是合成一些木質(zhì)素、生物堿、黃酮、異黃酮以及香豆素等次生物質(zhì)的重要前體[8]。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）是一類新確認的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能調(diào)節(jié)植物體保護酶活性及次生代謝酶類活性，促進基因表達，誘導蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)的合成[9]。已有研究表明，用10 μmol/L苯丙氨酸處理大豆懸浮細胞48 h后，懸浮細胞中大豆素含量增加為對照細胞的1.3倍，同時染料木素含量增加為對照的1.38倍[10]。羅建平等報道，用200 μmol/L茉莉酸甲酯處理懷槐懸浮培養(yǎng)細胞9 d后，可以使懸浮細胞中的異黃酮含量增加41718%[11]。本研究主要探討不同濃度的苯丙氨酸、茉莉酸甲酯處理對百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL等保護酶活性以及可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響，從而篩選出最佳添加濃度并進行精油的提取，為利用苯丙氨酸、茉莉酸甲酯調(diào)控百里香次生代謝產(chǎn)物含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為百里香（Thymus vulgaris L.）不定芽，品種名為冬季百里香。

1.2 材料培養(yǎng)與處理

百里香不定芽培養(yǎng)的對照培養(yǎng)基為MS+0.25 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA，附加0.6%瓊脂、3%蔗糖；在對照培養(yǎng)基中分別添加50、100、150、200、250 mg/L苯丙氨酸組成5水平的苯丙氨酸處理培養(yǎng)基；在對照培養(yǎng)基中分別添加50、100、150、200、250 μmol/L茉莉酸甲酯組成5水平的茉莉酸甲酯處理培養(yǎng)基。滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，其中苯丙氨酸、茉莉酸甲酯采用過濾滅菌，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種0.5 g不定芽，培養(yǎng)室溫度（25±2） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光照周期12 h/d。

1.3 生理指標的測定

百里香不定芽生長60 d后，取各個處理的芽體較幼嫩部分0.5 g進行生理指標的測定，每個處理3次重復。采用考馬斯亮藍G-250測定可溶性蛋白鮮質(zhì)量含量；蒽酮比色法測定可溶性糖鮮質(zhì)量含量；依據(jù)超氧化物歧化酶（SOD）抑制氮藍四唑（NBT）在光照下的還原程度來確定活性的大小，1 min 抑制NBT光化還原的50%為1個SOD活性單位（U）；過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，以1 min D470 nm變化0.01為1個酶活性單位（U）；多酚氧化酶（PPO）采用兒茶酚法測定，以1 min內(nèi)D525 nm變化0.01為1個酶活性單位（U）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）采用紫外吸收法測定，以1 min D290 nm變化0.01為1個酶活性單位（U）。以上生理指標的測定均參照王學奎的方法[12]。

1.4 精油的提取

切取百里香全苗，于自然條件下陰干，然后粉碎并置于 1 L 圓底燒瓶中，按1 g ∶10 mL料液比加入蒸餾水。采用水蒸氣蒸餾法，蒸餾時間為微沸3.0～3.5 h，將揮發(fā)油經(jīng)正己烷萃取，保存于2 mL Agilent樣品瓶中，置于4 ℃冰箱中待測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)整理后輸入Excel 2007進行處理，應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和LSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刺激劑濃度對百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響

2.1.1 苯丙氨酸濃度對百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響 由圖1可以看出，添加50～250 mg/L Phe均不同程度地提高了不定芽中可溶性蛋白的含量，且添加物處理與對照相比，均達到了顯著差異（P<0.05）；當加入 100 mg/L Phe時，不定芽中的可溶性蛋白質(zhì)的鮮質(zhì)量含量達到最高值3.21 mg/g，比對照極顯著提高了87.48%（P<001）；當增加Phe的濃度時，其增加的幅度在下降。由此可知，Phe的最佳濃度為100 mg/L，可溶性糖含量反映了體內(nèi)作為有效營養(yǎng)物的碳水化合物和能量水平。

由圖2可以看出，添加Phe后對不定芽中可溶性糖的影響與可溶性蛋白的影響相似，各個Phe濃度的處理的可溶性糖含量均顯著高于對照組，其中100 mg/L Phe可溶性糖的鮮質(zhì)量含量高達7.89 mg/g，極顯著高于其他處理。

2.1.2 茉莉酸甲酯濃度對百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影響 由圖3可以看出，在MJ處理下，極大地提高了不定芽中可溶性蛋白含量，說明添加MJ后細胞代謝更加活躍，促進了蛋白質(zhì)的大量合成。在50～150 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著MJ濃度的升高，促進作用增強；MJ濃度為 150 μmol/L 時，可溶性蛋白含量達到最大值7.66 mg/g，為對照的4.44倍；當濃度超過150 μmol/L后，其促進作用又開始下降，因此MJ最佳添加濃度為150 μmol/L。

由圖4可以看出，與對照相比，所有添加物處理都達到了極顯著差異且大部分處理之間都達到了極顯著差異（P<001），添加物處理的促進作用隨著濃度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的規(guī)律變化，當MJ添加濃度為150 μmol/L時，不定芽中可溶性糖含量達到最高值（7.69 mg/g，F(xiàn)W），比對照極顯著提高4919%（P<0.01）。

2.2 不同刺激劑對百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性的影響

2.2.1 苯丙氨酸對百里香不定芽中SOD、POD活性的影響 由圖5可以看出，添加一定濃度Phe后，誘導了SOD活性增強，隨著濃度的升高，SOD活性表現(xiàn)為先增強后減弱的變化趨勢，存在1個最佳濃度100 mg/L，其值高達 723.12 U/（g·min），約為對照的1.09倍。當Phe濃度超過100 mg/L時，其促進作用隨著濃度的升高而下降；當濃度為 250 mg/L 時，SOD活性明顯減弱，且顯著弱于對照（P<001），說明高濃度的Phe抑制了不定芽中SOD活性，使不定芽的抗氧化能力下降。

由圖6可以看出，所有添加物處理均不同程度地提高了不定芽中POD活性，與對照相比都達到了顯著差異。隨著Phe濃度的上升，POD活性的變化與SOD活性變化相似，也呈現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢。當添加濃度為100 mg/L時，POD活性最強，達到87.60 U/（g·min），約為對照的2.87倍。說明添加Phe后改善了植株的生理代謝，增強了POD活性，在一定程度上抑制了細胞因膜脂過氧化作用而引起的傷害。

2.2.2 苯丙氨酸對百里香不定芽中PPO、PAL活性的影響 由圖7可以看出，不同濃度的Phe對PPO的影響具有明顯的差異，隨著Phe濃度的升高，PPO活性呈現(xiàn)出先下降后上升的變化趨勢。在50～200 mg/L的濃度范圍內(nèi)，PPO的活性極顯著低于對照，其中100 mg/L Phe處理的PPO活性最弱，為194 U/（g·min），比對照極顯著降低了53.76%（P<0.01），說明添加適宜濃度的Phe后有效緩解了不定芽在生長后期的褐化現(xiàn)象。但當濃度增加至250 mg/L時，其PPO活性迅速增強，并且高于對照，說明高濃度的Phe能誘導PPO活性增強，使得不定芽褐化加重。

由圖8可以看出，在不同濃度的Phe處理下，PAL活性極顯著強于對照，說明Phe的添加誘導了PAL活性的增強，從而有利于不定芽次生代謝物質(zhì)的合成和積累。隨著Phe濃度的升高，PAL活性的變化趨勢與PPO活性的變化趨勢相反，PAL活性表現(xiàn)為先增強后減弱的趨勢，存在一個最佳濃度（100 mg/L），其PAL活性高達14.92 U，極顯著高于其他處理，約為對照的9.62倍。

2.2.3 茉莉酸甲酯對百里香不定芽中S0D、POD活性的影響 由圖9可以看出，就濃度效應來看，低濃度MJ極顯著地提高了不定芽中SOD活性，但高濃度MJ（250 μmol/L）卻也極顯著地抑制了SOD活性，MJ對SOD活性增強存在一個最佳濃度，即150 μmol/L，其SOD活性高達725.49 U/（g·min），約為對照的1.09倍。

由圖10可以看出，添加不同濃度的MJ后都不同程度地增強了不定芽中的POD活性，其中50～200 μmol/L濃度處理顯著高于對照處理（P<0.05），其中150 μmol/L MJ處理的POD活性最高，比對照顯著增強40.55%。 250 μmol/L MJ處理與對照差異不顯著。

2.2.4 茉莉酸甲酯對百里香不定芽中PPO、PAL活性的影響

由圖11可以看出，在50～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，PPO活性極顯著地低于對照，說明MJ的添加誘導了PPO活性的降低，從而可以緩解不定芽的褐化，延長不定芽的生長期。當MJ的濃度為150 μmol/L，其PPO活性極顯著低于其他處理；當繼續(xù)增加MJ濃度，PPO活性又開始上升，當濃度增加到 250 μmol/L 時，PPO活性顯著高于對照，說明高濃度MJ可能使不定芽的褐化程度加重。

由圖12可以看出，當添加MJ后，顯著增強了不定芽的中PAL活性，促進了不定芽次生代謝的發(fā)生。在50～150 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，PAL活性隨著MJ濃度的升高而增強；但在150～250 μmol/L濃度范圍內(nèi)，PAL活性隨著MJ濃度的升高而降低，說明150 μmol/L為MJ的最佳添加量，其PAL活性最強，高達9.33 U/（g·min），約為對照的1472倍。

綜上可知，當添加Phe、MJ濃度分別為100 mg/L、150 μmol/L 時，無論是不定芽的生物量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量還是代謝途徑中的各種酶活性都達到最佳水平，因此確定Phe、MJ調(diào)控百里香不定芽代謝的最適濃度分別為100 mg/L、150 μmol/L。

2.3 不同刺激劑對百里香精油提取率的影響

本試驗進一步研究了最佳添加濃度的100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ對百里香精油提取率的影響。其中，添加 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ、未添加任何物質(zhì)的百里香不定芽中百里香精油的提取率分別為0.42%、0.39%、0.31%，所得精油均含有松油味以及特殊香氣，顏色無明顯差別，均為金黃色，且經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析，3種樣品精油均含有百里香酚、香芹酚、對傘花烴、石竹烯等百里香精油的主要化學成分?？梢姡?jīng)100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ處理后促進了百里香不定芽精油的合成，其提取率分別比對照高355%、25.8%。

3 結(jié)論與討論

近年來，隨著植物組織和細胞培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，關于如何利用刺激劑來協(xié)迫植物細胞合成和積累次生代謝物已成為生物學家研究的熱點[13]。很多研究已經(jīng)證明，生物的和非生物的刺激劑能有效調(diào)節(jié)次生代謝途徑，促進目標次生代謝產(chǎn)物的高水平合成。如在甘草懸浮培養(yǎng)體系中添加10 mg/L水楊酸可以顯著提高甘草總黃酮的含量[14]；徐立新等報道，在人參毛狀根培養(yǎng)基中添加0.001 mmol/L茉莉酸甲酯可以促進人參皂苷的積累[15]；翟雪霞等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入 10 mg/L 苯丙氨酸，不僅可以明顯促進紅豆杉愈傷組織的生長，并且能顯著提高紫杉醇含量，使其值高達 0.224%[16]。本試驗結(jié)果表明，添加50～250 mg/L苯丙氨酸和50～250 μmol/L 茉莉酸甲酯都能提高百里香不定芽的增殖系數(shù)，促進生物量的大量積累，為植株進行次生代謝奠定物質(zhì)基礎。

刺激劑的添加不僅使細胞積極合成了植物防衛(wèi)的次生代謝物質(zhì)，如植保素、木質(zhì)素等，同時也啟動或加強了特定的次生代謝途徑，從而引起細胞的代謝變化，而這些代謝過程的發(fā)生主要是通過酶類的調(diào)控來實現(xiàn)的，蛋白質(zhì)含量的變化恰好反映了這些酶類的量變過程，其含量的高低可間接反映各種代謝活動的強弱[17]。王軍妮在桑樹試管苗培養(yǎng)時加入刺激劑Phe后，蛋白質(zhì)的含量發(fā)生了明顯的變化：桑葉中可溶性蛋白含量隨苯丙氨酸濃度的升高而升高[18]。本試驗結(jié)果顯示，添加不同濃度的Phe、MJ后都不同程度地促進了百里香不定芽中可溶性蛋白質(zhì)的含量，以100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ為最佳添加濃度，說明添加Phe、MJ后增強了百里香不定芽中各種代謝活動，促進了次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。

糖類是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關鍵因素之一，糖的種類和用量不僅影響培養(yǎng)物生長量和生長速度，并且影響其代謝水平和次生代謝產(chǎn)物的合成[18]。本試驗結(jié)果表明，在適宜濃度的Phe、MJ刺激下，百里香不定芽中的可溶性糖含量顯著升高，使不定芽因碳源充足而快速生長；同時，可溶性糖還具有滲透調(diào)節(jié)的作用，從而影響不定芽次生代謝產(chǎn)物的合成。

已有研究證明，刺激劑加入到細胞培養(yǎng)體系后，大量自由基的產(chǎn)生誘發(fā)了自由基防御體系中酶保護系統(tǒng)的顯著變化，以實現(xiàn)對細胞自身的保護[13]。本試驗結(jié)果顯示，添加適宜濃度的Phe、MJ能使不定芽SOD、POD活性顯著增強，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ效果最佳，說明添加這2種刺激劑有利于酶活性的表達，可以減輕活性氧積累，提高保護酶活性，使不定芽表現(xiàn)出更強的抗氧化能力，有效緩解各種脅迫對植物不利的影響，維持其正常的生理代謝功能。

PAL存在于所有綠色植物中，是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸[19]，程小萍等研究發(fā)現(xiàn)，酵母寡聚糖刺激劑可促進丹參細胞內(nèi)PAL活性的增強，有利于丹參酮等次生代謝產(chǎn)物的合成[20]。嚴文文等也報道，在含有CoCl2的MS培養(yǎng)基中添加茉莉酸甲酯可以提高煙草愈傷組織中的PAL活性[21]。本試驗結(jié)果表明，與CK相比，添加適量Phe、MJ后，能增強百里香不定芽中的PAL活性，且隨著濃度的上升，其活性增強的幅度在上升，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ 處理的PAL活性分別達到1492、9.33 U/（g·min），極顯著高于其他處理，說明適宜濃度的Phe、MJ改善了百里香不定芽的生理代謝，促進了其次生代謝產(chǎn)物的積累。

百里香作為重要的芳香植物，其精油的應用價值高，但是目前關于離體培養(yǎng)條件下如何提高其精油含量的研究甚少。本試驗通過苯丙氨酸、茉莉酸甲酯2種刺激劑對百里香不定芽生長增殖，不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響，篩選出最佳苯丙氨酸（100 mg/L）、茉莉酸甲酯（150 μmol/L）的添加濃度，在此基礎上，進行精油的提取，其精油得率有所提高，分別比對照高35.5%、25.8%，且精油的質(zhì)量良好，其主要化學成分沒有變化，均含有百里香酚、香芹酚、對傘花烴、石竹烯等百里香精油的主要化學成分，這為進一步調(diào)控百里香次生代謝途徑、提高精油含量打下了一定的基礎。

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