篦子三尖杉牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的克隆與序列分析

齊小瓊+胡晨熙+李大衛(wèi)

摘要：三尖杉是我國特有植物，主要含有生物堿、黃酮及萜類等生物活性物質(zhì)。以篦子三尖杉為試驗材料，根據(jù)同源克隆的方法擴增三尖杉牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）基因，并通過生物信息的方法對該基因進行鑒定和分析。結(jié)果表明，篦子三尖杉GGPPS基因全長1 217 bp，含有1個完整的1 182 bp開放閱讀框（ORF），編碼393個氨基酸的蛋白序列，GGPPS蛋白相對分子量為43.042 ku，理論等電點（pI）為6.57，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成；蛋白質(zhì)同源分析表明，三尖杉GGPPS含有多聚異戊二烯基合成酶家族中保守的5個特征性結(jié)構(gòu)和2個富含天冬氨酸的區(qū)域；同源模建分析顯示，三尖杉GGPPS具有GGPPS蛋白典型的三維結(jié)構(gòu)，特別與薄荷GGPPS蛋白的三維結(jié)構(gòu)及活性位點極其相似；系統(tǒng)進化分析表明，三尖杉GGPPS蛋白歸屬植物進化支，且與加拿大紅豆杉、曼地亞紅豆杉、海南粗榧的GGPPS蛋白歸為同一分支。

關(guān)鍵詞：篦子三尖杉；萜類化合物；牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）；克??；序列分析；同源模建；系統(tǒng)進化

中圖分類號： S188；Q785

文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0079-04

萜類化合物是植物代謝中數(shù)量最多的一類代謝物，以異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元，在植物的光合作用、呼吸作用、生長、發(fā)育、繁殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和防御中發(fā)揮重要作用。植物中存在的某些萜類具有重要的經(jīng)濟價值和藥用價值，如紅豆杉（Taxus）中的二萜紫杉醇[1]、銀杏（Ginkgo biloba）中的二萜銀杏內(nèi)酯和倍半萜白果內(nèi)酯[2-3]、青蒿（Artemisia annua）中的倍半萜青蒿素[4]等。三尖杉屬（Cephalotaxus）植物主要含有生物堿、黃酮類化學(xué)成分，其中的三尖杉酯類生物堿由于具有明顯的抗癌活性得到了深入研究，關(guān)于黃酮類成分的研究較少。除此之外還含有一些萜類化合物，如二萜類的海松酸、柳杉酚等，初步研究表明，該類化合物對微生物有抑制作用[5]。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）是包括紫杉醇、銀杏內(nèi)酯、海松酸、柳杉酚在內(nèi)的所有二萜類化合物的共同前體，由牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化，通過類異戊二烯合成途徑生成。在該反應(yīng)途徑中，GGPPS催化15 C的法呢基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，F(xiàn)PP）與5 C的異戊烯焦磷酸（isopentenylallyl diphosphate，IPP）縮合生成GGPP[6-7]。因此，GGPPS是紅豆杉植物合成紫杉醇、銀杏合成銀杏內(nèi)酯、三尖杉屬植物合成海松酸和柳杉酚的關(guān)鍵酶之一。在三尖杉中克隆該基因并分析其序列的結(jié)構(gòu)特征和進化模式，將為后續(xù)的功能研究和基因工程、代謝工程等技術(shù)手段大量獲得有用產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri）摘采于中國科學(xué)院武漢植物園，取其嫩葉立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要分子生物學(xué)試劑 普通Taq DNA聚合酶、高保真 LA Taq 酶、dNTP等試劑，購自TaKaRa；DNA凝膠純化回收試劑盒，購于Axygen生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 篦子三尖杉GGPPS基因的克隆

1.2.1.1 引物的設(shè)計 用加拿大紅豆杉 （Taxus canadensis） GGPPS蛋白（登錄號：AADl6018）作為查詢序列，進行Blastp相似性搜索，在三尖杉屬植物海南粗榧（C. hainanensis）中得到1條同目標(biāo)序列相似性較高的序列 （登錄號：GBHQ10039.1）。根據(jù)這條序列設(shè)計3對特異引物（分別位于中部和左右端部），詳見表1。

1.2.1.2 篦子三尖杉GGPPS基因的分段擴增 以提取的篦子三尖杉總DNA為模板，分別以F1-1、R1-2，F(xiàn)2-1、R2-2，F(xiàn)3-1、R3-2為引物進行PCR擴增。擴增體系為25 μL，包含2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus），2 μL dNTP混合物（每種2.5 mmol/L），各1 μL引物（10 μmol/L），0.5 μL Ex-Taq（2 U/μL），1 μL DNA模板（25 ng/μL），補加17 μL的水。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

PCR結(jié)束后，進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，對擴增的DNA進行檢測。

1.2.2 產(chǎn)物回收、測序 擴增片段的凝膠回收按照試劑盒說明書進行操作，將回收的目的片段送華大基因測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用BioEdit（North Carolina State University） 軟件對克隆測序得到的片段進行拼接。采用ORF finder進行開放閱讀框確定。運用DNAstar軟件推測氨基酸序列，運用分析蛋白質(zhì)物理化學(xué)的Expasy Protparam軟件（http：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白質(zhì)的分子量、理論等電點、氨基酸組成。查詢Prosite數(shù)據(jù)庫查找蛋白質(zhì)含有的序列模式和功能域，使用在線軟件SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)并計算各種二級結(jié)構(gòu)所占百分比。使用SWISS-MODEL服務(wù)器[8-10] （http：//swissmodel.expasy.org/），基于同源建模的原理，進行篦子三尖杉GGPPS三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，預(yù)測結(jié)果用PyMOL軟件展示和編輯。

以篦子三尖杉GGPPS蛋白作為查詢序列，運用Blast工具（http//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性搜索，并選取相似性較高的序列用MEGA 6軟件[11]中的鄰接算法進行進化樹的構(gòu)建，其中多重序列比對使用Clustalx軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 篦子三尖杉GGPPS序列的獲得與分析

采用改良的CTAB 法獲取篦子三尖杉總DNA，并通過電泳進行純度檢測，結(jié)果見圖1。用引物F2-1、R2-2進行PCR擴增，最終獲得560 bp左右的三尖杉GGPPS的中間片段（圖1-A）。分別以引物F1-1、R1-2，F(xiàn)3-1、R3-2進行PCR擴增，最終分別獲得 700、750 bp左右的上、下游片段（圖1-B、1-C）。產(chǎn)物經(jīng)回收純化和測序，用BioEditor軟件進行拼接，獲得1條總長為1 217 bp的GGPPS DNA序列。用ORF Finder軟件預(yù)測開放閱讀框（ORF），結(jié)果顯示：該DNA序列包含1段1 182 bp的完整編碼區(qū)，編碼393個氨基酸。將獲得的基因組DNA序列與已報道的海南粗榧mRNA進行比對發(fā)現(xiàn)，篦子三尖杉GGPPS基因不含有內(nèi)含子，與大多數(shù)植物一樣，在外顯子-內(nèi)含子的進化上是保守的。

2.2 篦子三尖杉GGPPS蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)特征分析

篦子三尖杉GGPPS基因完整的開放閱讀框（ORF）長為1 182 bp，編碼393個氨基酸（圖2），相對分子質(zhì)量約為 43.042 ku，理論等電點為6.57。在氨基酸序列中，含量最高的為丙氨酸（Ala，39個）、亮氨酸（Leu，39個），均占9.92%；其次是賴氨酸（Lys，33個，占8.40%）、天門冬氨酸（Asp，29個，占7.28%）、蘇氨酸（Thr，27個，占6.87%）、纈氨酸（Val，27個，6.87%）。酸性氨基酸[天門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）]總數(shù)52個，堿性氨基酸[精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）]50個；總親水性平均系數(shù)為-0.147。Prosite數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，三尖杉GGPPS蛋白序列的177～193氨基酸位（氨基酸序列：LIhDDlpcmDnddfRRG）和311～323氨基酸位（氨基酸序列：VGllFQVvDDIlD）分別是2個多聚異戊二烯基合成酶的特異序列（圖3）。

SOPMA分析表明，α-螺旋（alpha helix，Hh）、無規(guī)則卷曲（random coil，Cc）是三尖杉GGPPS蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要成分，組成α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈氨基酸比例分別為45.80%、41.48%、12.72%，不含其他結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤繞、折疊形成的，決定了蛋白質(zhì)的功能。在SWISS-MODEL服務(wù)器上預(yù)測篦子三尖杉GGPPS蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，與薄荷（Menthax piperita）GGPPS蛋白同源性最高（PDB ID：3krp.2.A），為68.37%。以此結(jié)構(gòu)為模型構(gòu)建篦子三尖杉的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有植物GGPPS蛋白典型的三維結(jié)構(gòu)，說明功能也非常類似，該蛋白在進化上很保守 （圖4）。

2.3 GGPPS蛋白質(zhì)同源性分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

Blast比對結(jié)果顯示，三尖杉GGPPS蛋白質(zhì)序列與已報道的海南粗榧（C. hainanensis）、加拿大紅豆杉（T. Canadensis）、曼地亞紅豆杉（Taxus xmedia）、挪威云杉（Picea abies）、銀杏（Ginkgo biloba）、煙草（Nicotiana tabacum）、北美冷杉（Abies grandis）、馬尾松（Pinus massoniana）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、巴豆（Croton sublyratus）、大豆（Glycine max）、美花煙草（Nicotiana sylvestris）等12種高等植物GGPPS蛋白質(zhì)的一致性分別為98.9%、89.5%、88.8%、70.4%、70.1%、54.3%、69.4%、67.6%、54.0%、54.5%、54.4%、54.5%。多序列同源比對分析結(jié)果表明，不同植物來源的GGPPS蛋白質(zhì)的N末端差異很大，C末端保守性強。GGPPS蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上屬于多聚異戊二烯合成酶家族，該家族具有5個保守功能域（Ⅰ～Ⅴ），5個保守區(qū)域中包含2個富含天冬氨酸區(qū)域：DDXXXXD、DDXXD。在篦子三尖杉GGPPS氨基酸序列中存在這樣的5個保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域Ⅱ、結(jié)構(gòu)域Ⅴ中也分別發(fā)現(xiàn)富含天冬氨酸的基序DDLPCMD、DDILD（圖5）。

采用Neighbor-joining算法，在MEGA 6軟件平臺上構(gòu)建植物GGPPS的分子系統(tǒng)進化樹（圖6）。對比植物GGPPS分子系統(tǒng)進化樹，三尖杉GGPPS蛋白歸屬于裸子植物進化支，且與海南粗榧、加拿大紅豆杉、挪威云杉、北美冷杉、馬尾松的GGPPS蛋白歸為同一小分支（圖6）。被子植物、裸子植物GGPPS各形成獨立的分支，兩者形成姊妹關(guān)系，說明這兩大分支從同一祖先平行分化而來；該基因樹與物種樹基本吻合，說明該基因的進化與物種的分化基本一致。

3 結(jié)論

通過PCR技術(shù)克隆獲得的篦子三尖杉GGPPS DNA序列長度為1 217 bp，含有1 182 bp的完整開放閱讀框。三維結(jié)構(gòu)模擬表明：該蛋白具有GGPPS蛋白典型的三維結(jié)構(gòu)；多重序列比對顯示，三尖杉GGPPS 蛋白與其他物種來源的GGPPS蛋白相似性較高，尤其是與海南粗榧、加拿大紅豆杉、曼地亞紅豆杉的GGPPS相似性高達88%以上，它們都包含多聚異戊二烯合成酶家族的5個保守性結(jié)構(gòu)域（圖5）。在三尖杉GGPPS蛋白的氨基酸序列的177～193、311～323位分別是2個多聚異戊二烯基合成酶的特異序列LIhDDlpcmDnddfRRG、VGllFQVvDDIlD（圖3），這2個保守的富含天冬氨酸的區(qū)域位于酶的催化活性位點，與IPP、烯丙基底物的結(jié)合有關(guān)。從結(jié)構(gòu)到功能預(yù)測都顯示，克隆的基因具有典型的GGPPS特征，因此克隆的篦子三尖杉GGPPS編碼蛋白很可能參與或調(diào)節(jié)了三尖杉二萜類等物質(zhì)的生物合成，但完全闡明三尖杉萜類化合物的生物合成和調(diào)控機制還需要進行進一步試驗驗證。

參考文獻：

[1]占愛瑤，由香玲，詹亞光. 植物萜類化合物的生物合成及應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通訊，2010，21（1）：131-135.

[2]朱 俊，許 鋒，廖詠玲. 銀杏萜內(nèi)酯調(diào)控研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（7）：301-305.

[3]張洪娟，譚碧玥，曹福亮. 銀杏GbGGPS基因的克隆及序列分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，37（4）：8-12.

[4]陳大華，葉和春，李國鳳，等. 植物類異戊二烯代謝途徑的分子生物學(xué)研究進展[J]. 植物學(xué)報，2000，42（6）：551-558.

[5]Politi M，Braca A，de Tommasi N，et al. Antimicrobial diterpenes from the seeds of Cephalotaxus harringtonia var. drupacea[J]. Planta Medica，2003，69（5）：468-470.

[6]Lange B M，Rujan T，Martin W，et al. Isoprenoid biosynthesis：the evolution of two ancient and distinct pathways across genomes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（24）：13172-13177.

[7]Rodríguez-Concepción M，Boronat A. Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic milestone achieved through genomics[J]. Plant Physiology，2002，130（3）：1079-1089.

[8]Biasini M，Bienert S，Waterhouse A，et al. SWISS-MODEL：modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（W1）：W252-W258.

[9]Arnold K，Bordoli L，Kopp J，et al. The SWISS-MODEL workspace：a web-based environment for protein structure homology modelling[J]. Bioinformatics，2006，22（2）：195-201.

[10]Benkert P，Biasini M，Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J]. Bioinformatics，2011，27（3）：343-350.

[11]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.趙金艷，盧 宏，張振武，等. 快速PCR介導(dǎo)的NeuroD-3′UTR的定點突變研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：83-86.