擬南芥缺失突變體at14a的比較轉(zhuǎn)錄組分析

王琳+孫慶玲+劉輝+梁建生

摘要：以at14a相關(guān)基因型（野生、缺失）擬南芥植株為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)等方法，分析野生型（col）、缺失突變體（at14a）擬南芥差異基因表達(dá)狀況，初步探討擬南芥AT14A的功能。結(jié)果表明：at14a在擬南芥植株根、莖、葉和花中均有表達(dá)，尤其在葉片中的表達(dá)量較高；相較于野生型，缺失突變體at14a中有194個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因122個(gè)，下調(diào)基因72個(gè)；通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，2種基因型植株差異基因主要參與了應(yīng)答脅迫過(guò)程，這表明at14a可能通過(guò)調(diào)控AT5G39610、AT1G53240、AT4G32770、AT1G02920、AT1G10760這些逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)參與應(yīng)答脅迫。差異分子主要定位于細(xì)胞核，具有綁定的分子功能。通過(guò)pathway分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因型植株差異基因主要參與了核糖體代謝、碳水化合物代謝、光合等代謝途徑。研究結(jié)果為深入研究at14a作用的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：AT14A；擬南芥；缺失突變體；基因芯片；轉(zhuǎn)錄組學(xué)

中圖分類號(hào)：S188；Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0070-04

植物細(xì)胞壁可能與膜蛋白相互作用，其中一類膜蛋白就是與動(dòng)物細(xì)胞整合素蛋白相似的類整合素蛋白。整合素是動(dòng)物細(xì)胞黏附分子的重要成員，屬于一類跨膜蛋白的超家族，是由2個(gè)跨膜糖蛋白亞基（α、β）通過(guò)非共價(jià)鍵連接而成的異二聚體，它們黏附于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）并結(jié)合細(xì)胞骨架。整合素分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其成為動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵分子之一，它能介導(dǎo)細(xì)胞膜雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，即通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外的信號(hào)從而調(diào)控其與細(xì)胞外配體的結(jié)合活性；同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)與整合素的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞過(guò)程。整合素在多種生理活動(dòng)中具有重要的功能，它們調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移、極性、生長(zhǎng)、分化，并與基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件相互作用[1-3]。在植物中，整合素尚未被證實(shí)，有可能是因?yàn)橹参镆呀?jīng)將這些蛋白功能以不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方式進(jìn)行組合，以適應(yīng)植物質(zhì)膜的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，并與細(xì)胞壁相互作用[4]。自從Schindler等首次發(fā)現(xiàn)與動(dòng)物整合素具有相似功能的類整合素蛋白以來(lái)，在植物中已經(jīng)確定了許多類整合素蛋白[5-6]。

Nagpal等在1999年報(bào)道了在擬南芥cDNA庫(kù)中用抗脊椎動(dòng)物整合素β1亞基胞內(nèi)高度保守結(jié)構(gòu)域抗體作探針?lè)蛛x和鑒定出1個(gè)與整合素具有部分相似序列的cDNA克隆——AT14A，這為植物類整合素的存在提供了直接證據(jù)。AT14A（At3G28300）編碼基因有1個(gè)1 154 bp的開放閱讀框，只存在1個(gè)外顯子，由1 459個(gè)核苷酸組成，其中10至1 164位核苷酸組成編碼385個(gè)氨基酸的蛋白，分子量預(yù)測(cè)為43 ku。序列分析發(fā)現(xiàn)，AT14A蛋白有1個(gè)小的結(jié)構(gòu)域與真菌、昆蟲和人類的整合素存在序列相似性，并有1個(gè)編碼11個(gè)氨基酸的高度保守區(qū)，它與人類D1整合素胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域同源性較高[7]。筆者前期研究表明，擬南芥AT14A蛋白功能類似于動(dòng)物中的整合素，介導(dǎo)了懸浮細(xì)胞細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體（WMC）的連接[8]。然而，關(guān)于AT14A發(fā)揮生理功能的機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是新興的研究細(xì)胞表型和功能的重要手段，在研究基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和功能上開拓了新型研究方向。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）概念最先是由Velculescu等在1997年提出的，是指某一特定生物體在特定狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，主要包括mRNA、非編碼RNA[9]。相對(duì)于基因組而言，轉(zhuǎn)錄組更具有時(shí)間性、空間性，轉(zhuǎn)錄組反映的是特定條件下活躍表達(dá)的基因[10]，基因芯片技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的常用方法。它起源于20世紀(jì)90年代，是指高密度固定在硅片、玻片、陶瓷等固相支持介質(zhì)上的生物分子微陣列，具有快速、高效、微型化、高通量、大規(guī)模、高度并行性等特點(diǎn)[11]。因此，本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)分析AT14A對(duì)擬南芥基因表達(dá)的影響，從而探討AT14A的功能，以期為類整合素的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的植物材料是擬南芥（Arabidopsis thaliana）。at14a基因位于3號(hào)染色體上，編號(hào)為AT3G28300。以野生型（Col）、純合突變體（at14a）（SALK_101761）2種基因型擬南芥為材料。野生型擬南芥（Col）由加拿大大不列顛哥倫比亞大學(xué)陳金桂博士提供，后經(jīng)筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行繁種保存。at14a是AT14A的T-DNA插入功能缺失突變體。以不同組織的擬南芥為材料，提取總RNA，用于at14a基因的表達(dá)分析。以生長(zhǎng)6周的擬南芥葉片為材料，提取總RNA，用于基因芯片分析。

1.2 試劑

總RNA提取試劑盒：RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技（北京）有限公司]；cDNA第1鏈合成試劑盒（Roche）；RT-qPCR Mix（Bio-Rad）；RNA提取和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中所用EP管及槍頭均為無(wú)菌級(jí)（美國(guó)Axygen公司）；熒光定量PCR試劑盒：SYBR Green Supermix（美國(guó)BIO-RAD公司）；Taq DNA 聚合酶：Thermo Scientific DreamTaq Green DNA聚合酶。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.3 熒光定量PCR方法

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明，提取擬南芥葉片總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于at14a的表達(dá)分析。以擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中的at14a基因編碼序列為參照，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)at14a基因定量PCR引物。以根、莖、葉、花等組織的cDNA 為模板，擴(kuò)增擬南芥at14a基因，進(jìn)行表達(dá)量分析。反應(yīng)體系20 μL，其中上下游引物各0.5 μL，定量PCR混合液10 μL，模板cDNA 1 μL，補(bǔ)雙蒸水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，導(dǎo)出數(shù)據(jù)使用ABI 7300自帶軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 基因芯片分析

1.4.1 RNA樣品制備及芯片雜交 采用Trizol法提取擬南芥葉片中的總RNA，通過(guò)異丙醇沉淀法濃縮RNA，并進(jìn)一步采用RNeasy Mini Spin Column試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行柱純化，用分光光度計(jì)定量、甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。采用RNA擴(kuò)增標(biāo)記方法合成帶生物素標(biāo)記的cRNA，將純化后的cRNA與Agilent 公司擬南芥全基因組芯片雜交過(guò)夜，然后在芯片工作站進(jìn)行芯片洗脫，采用芯片掃描儀進(jìn)行掃描。這些工作均由北京博奧生物有限公司完成，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析 采用Feature Extraction圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，將圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。然后對(duì)信號(hào)值進(jìn)行歸一化處理，用SAM（Significance Analysis of Microarrays）軟件進(jìn)行差異基因的分析。FDR控制在5%以內(nèi)，再以倍數(shù)變化大于2倍或小于50%的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因。

1.5 生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)通過(guò)TAIR Gene Ontology （GO） Annotations tool （http：//www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp ）和MAS（Molecular Annotation System）系統(tǒng)對(duì)差異基因進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

研究中每個(gè)值的表達(dá)方式為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”，不同處理之間進(jìn)行了多重比較，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 at14a的組織表達(dá)特性

圖1表明，在擬南芥根、莖、葉和花各組織中，at14a都有表達(dá)，尤其是葉片中的at14a基因表達(dá)量最高，根、莖中的at14a表達(dá)量最低，花中at14a表達(dá)量居于兩者之間。

2.2 總RNA質(zhì)檢和芯片雜交質(zhì)量檢測(cè)

采用Trizol法提取6個(gè)擬南芥樣本葉片的總RNA，純化后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定D230 nm、D260 nm、D280 nm，計(jì)算出各RNA樣品的濃度（表1）。由圖2可知，RNA樣品電泳條帶清晰?？傮w看出，RNA樣品的純度、總量及完整性符合Agilent表達(dá)譜芯片試驗(yàn)要求，可以繼續(xù)后續(xù)芯片試驗(yàn)。

6個(gè)樣本純化后cRNA產(chǎn)物分別與芯片進(jìn)行雜交和掃描，芯片雜交掃描結(jié)果顯示擬南芥基因組中所有基因表達(dá)的熒光原始信號(hào)強(qiáng)度。由圖3可知，芯片四周邊界點(diǎn)線均勻一致，表明芯片質(zhì)量可靠。信號(hào)檢測(cè)報(bào)告表明：樣品各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)達(dá)到質(zhì)控要求，雜交控制探針等陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)、看家基因信號(hào)值正常；平均背景值與噪音值較低；陽(yáng)性率數(shù)值正常。這些結(jié)果說(shuō)明，本組基因芯片的質(zhì)量、雜交和檢測(cè)體系均無(wú)問(wèn)題，芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。

2.3 不同基因型擬南芥轉(zhuǎn)錄組分析

通過(guò)軟件對(duì)野生型（col）和缺失突變體（at14a）植株葉片的差異基因進(jìn)行了分析。由圖4可知，野生型與缺失突變體植株的差異基因共194個(gè)，其中122個(gè)上調(diào)，72個(gè)下調(diào)。

2.3.1 不同基因型擬南芥差異基因的基因本體（Gene Ontology）分析 Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)旨在建立注釋基因和蛋白質(zhì)知識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)詞匯體系。GO功能注釋包括細(xì)胞定位（cellularcomponent）、分子功能（molecular function）、生物學(xué)過(guò)程（biological processes），3者緊密聯(lián)系，共同描述基因的特征。細(xì)胞定位是指基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置；分子功能描述基因或基因產(chǎn)物的分子生物學(xué)活性和功能；生物學(xué)過(guò)程通常由多種分子功能有序組成。通過(guò)Gene Ontology分析，有助于更好地了解擬南芥at14a缺失后，植株基因表達(dá)的變化規(guī)律。由圖5-A可知，2個(gè)基因型植株葉片差異基因參與的生物過(guò)程多種多樣，如細(xì)胞代謝、應(yīng)答脅迫、運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄等，應(yīng)答脅迫是其中比較重要的過(guò)程。這從轉(zhuǎn)錄水平上說(shuō)明，定位于質(zhì)膜的at14a作為細(xì)胞壁-質(zhì)膜-細(xì)胞骨架連續(xù)體的中間分子，可能在擬南芥響應(yīng)脅迫過(guò)程中起關(guān)鍵作用。由圖5-B可知，2個(gè)基因型植株葉片差異基因主要定位于細(xì)胞核，分布比例高達(dá)20.35%，其次是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)、葉綠體等部位。這為at14a定位于質(zhì)膜，并參與細(xì)胞壁的組成提供了組織基礎(chǔ)。由圖5-C可知，2個(gè)基因型植株葉片差異基因主要具有綁定功能，還有轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、水解酶活性等功能。這表明at14a具有和其他基因相互作用的分子基礎(chǔ)。

2.3.2 不同基因型擬南芥差異基因的Pathway分析 日本京都基因和基因組百科全書（KEGG）是生物系統(tǒng)學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)，它整合了細(xì)胞功能、生物體特性知識(shí)，描述了分子間相互作用。由圖6可知，2種基因型植株葉片差異基因參與的代謝途徑多種多樣，如核糖體代謝、淀粉與蔗糖代謝、氨基糖代謝、與細(xì)胞色素P450相關(guān)的異源性代謝、葉綠素卟啉環(huán)代謝、乙醛酸代謝、色氨酸代謝、光合代謝等。這些結(jié)果表明，at14a可能參與這些代謝途徑的調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

葉片在植物光合作用、蒸騰作用、水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，從而影響整個(gè)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。因此，葉片組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中具有舉足輕重的作用。at14a在葉片中表達(dá)較高，這為它在生物進(jìn)程中發(fā)揮功能提供了組織基礎(chǔ)。

近期的研究表明，AT14A是WMC連續(xù)體中必不可少的核心分子，可以作為植物細(xì)胞壁和細(xì)胞骨架之間的連接載體，與動(dòng)物整合素一樣，在控制極性和形態(tài)中起重要作用。它參與了細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞壁間的黏附，并參與了滲透脅迫誘導(dǎo)的質(zhì)-壁分離過(guò)程[8]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在植物細(xì)胞中WMC連續(xù)體對(duì)脅迫起重要的調(diào)控作用，但是它通過(guò)膜蛋白介導(dǎo)的分子機(jī)制還不清楚。相關(guān)研究表明，植物類整合素參與了霉菌毒素的滲透作用、機(jī)械刺激應(yīng)答、細(xì)胞壁黏附等[12]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因型植株差異基因主要參與了應(yīng)答脅迫過(guò)程。

AT5G39610（ATNAC2）是編碼NAC結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。

在鹽脅迫下，野生型、NTHK1轉(zhuǎn)基因株系中該基因表達(dá)上調(diào)；此外，它還參與氧化脅迫[13]。AT4G32770（VTE1）編碼生育酚環(huán)化酶，與生育酚（維生素E）的合成有關(guān)，它參與應(yīng)答高光、氧化、低溫等逆境脅迫過(guò)程[14]。AT1G53240（MMDH1）編碼線粒體蘋果酸脫氫酶，它參與冷脅迫和鹽脅迫應(yīng)答過(guò)程，并參與細(xì)菌防御反應(yīng)；它還參與蘋果酸、三羧酸循環(huán)等碳水化合物的代謝過(guò)程[15]。AT1G02920（GST11）編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，具有和鈷離子、銅離子、谷胱甘肽結(jié)合的功能，它定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和液泡等部位，參與應(yīng)答鹽脅迫、細(xì)菌和真菌防御，還參與谷胱甘肽代謝和毒素分解代謝等途徑[16]。AT1G10760（SEX1）編碼淀粉降解所需的α-葡聚糖水合二激酶，它具有α-葡聚糖水合二激酶活性，能與ATP、金屬離子結(jié)合，它定位于葉綠體、線粒體等部位，參與了應(yīng)答冷脅迫過(guò)程，與淀粉分解途徑有關(guān)[17]。AT14A可能通過(guò)調(diào)控這些逆境相關(guān)脅迫基因的表達(dá)，從而參與了擬南芥響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程。

本試驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)的方法初步分析了擬南芥缺失突變體at14a的基因表達(dá)變化及其參與的生物學(xué)過(guò)程和代謝途徑等，分析結(jié)果較直觀，為進(jìn)一步研究at14a作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hynes R O. Integrins：bidirectional，allosteric signaling machines[J]. Cell，2002，110（6）：673-687.

[2]Qin J，Vinogradova O，Plow E F. Integrin bidirectional signaling：a molecular view[J]. PLoS Biology，2004，2（6）：726-729.

[3]Wegener K L，Partridge A W，Han J，et al. Structural basis of integrin activation by talin[J]. Cell，2007，128（1）：171-182.

[4]Kumar M N，Hsieh Y F，Verslues P E. At14a-Like1 participates in membrane-associated mechanisms promoting growth during drought in Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（33）：10545-10550.

[5]Nick P. Microtubules，signalling and abiotic stress[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2013，75（2）：309-323.

[6]Schindler M，Meiners S，Cheresh D A. RGD-dependent linkage between plant cell wall and plasma membrane：consequences for growth[J]. Journal of Cell Biology，1989，108（5）：1955-1965.

[7]Nagpal P，Quatrano R S. Isolation and characterization of a cDNA clone from Arabidopsis thaliana with partial sequence similarity to integrins[J]. Gene，1999，230（1）：33-40.

[8]Lü B，Liang J S，Zhang J H，et al. AT14A mediates the cell wall-plasma membrane-cytoskeleton continuum in Arabidopsis thaliana cells[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（11）：4061-4069.

[9]Velculescu V E，Zhang L，Zhou W，et al. Characterization of the yeast transcriptome[J]. Cell，1997，88（2）：243-251.

[10]章 瓊，蔣高中，李 冰. 水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)氨氮脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：227-230.

[11]魏松紅，劉志恒，紀(jì)明山，等. 基因芯片技術(shù)在植物病害中的應(yīng)用[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：20-22.

[12]Knepper C，Savory E A，Day B. Arabidopsis NDR1 is an integrin-like protein with a role in fluid loss and plasma membrane-cell wall adhesion[J]. Plant Physiology，2011，156（1）：286-300.

[13]He X J，Mu R L，Cao W H，et al. AtNAC2，a transcription factor downstream of ethylene and auxin signaling pathways，is involved in salt stress response and lateral root development[J]. The Plant Journal，2005，44（6）：903-916.

[14]Havaux M，Eymery F，Porfirova S，et al. Vitamin E protects against photoinhibition and photooxidative stress in Arabidopsis thaliana[J].The Plant Cell，2005，17（12）：3451-3469.

[15]Nakaminami K，Matsui A，Nakagami H A，et al. Analysis of differential expression patterns of mRNA and protein during cold-acclimation and de-acclimation in Arabidopsis[J]. Molecular & Cellular Proteomics，2014，13（12）：3602-3611.

[16]Kouno T，Ezaki B. Multiple regulation of Arabidopsis AtGST11 gene expression by four transcription factors under abiotic stresses[J]. Physiologia Plantarum，2013，148（1）：97-104.

[17]Yano R，Nakamura M，Yoneyama T，et al. Starch-related α-glucan/water dikinase is involved in the cold-induced development of freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2005，138（2）：837-846.張彥妮，李兆婷，張艷波，等. 毛百合試管鱗莖形成和膨大的培養(yǎng)優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：74-78.