玉米轉(zhuǎn)錄因子基因ZmASR1的克隆及植物表達載體構(gòu)建

張麗麗+李博+譚燕華+曹揚+易小平

摘要：為深入研究玉米轉(zhuǎn)錄因子基因ZmASR1的功能，提高玉米株系的產(chǎn)量和抗逆性，根據(jù)http：//www.maizegdb.org/ 網(wǎng)站上公布的玉米自交系B73的ZmASR1序列和Cornejo發(fā)表的Ubiquitin啟動子的序列，設(shè)計引物從玉米自交系B73的DNA序列中克隆了ZmASR1基因和Ubiquitin啟動子，并對ZmASR1基因進行了生物信息學分析。序列分析結(jié)果表明，ZmASR1基因DNA全長為1 381 bp，包含1個長度為131 bp的內(nèi)含子序列，存在1個完整的開放閱讀框417 bp，編碼138個氨基酸。氨基酸序列分析表明其具有ASR家族典型的保守結(jié)構(gòu)域ABA_WDS（abscisic acid/water deficit stress），氨基酸序列的N端有該家族成員所特有的依賴于Zn2+的DNA結(jié)合位點，而C端則有1個核定位信號，玉米的ZmASR1與單子葉植物的ZmASR1親緣關(guān)系較近，而與雙子葉植物的ZmASR1親緣關(guān)系較遠。并構(gòu)建了同時帶有該啟動子和ZmASR1基因的植物表達載體。

關(guān)鍵詞：玉米；Ubiquitin啟動子；ZmASR1基因；生物信息學；植物表達載體

中圖分類號： Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0016-06

玉米生產(chǎn)在保障我國糧食安全中具有十分重要的戰(zhàn)略地位，玉米在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是我國播種面積最大的農(nóng)作物，同時也是我國產(chǎn)量第一大糧食作物，是主要的糧食飼料兼用作物，以產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富且用途廣泛而被譽為三冠王——高產(chǎn)之王、飼料之王、加工原料之王。玉米的重要性為玉米的發(fā)展提供了難得的機遇，但同時我們也必須清醒地認識到玉米生產(chǎn)中遇到的現(xiàn)實困難。糧食產(chǎn)量下降是由各種生物和非生物脅迫的影響造成的，干旱是最重要的環(huán)境脅迫，超過任何其他環(huán)境因素，嚴重損害植物的生長和發(fā)育，限制植物生產(chǎn)和作物的性能[1]。玉米是對水分反應(yīng)敏感的旱地作物，玉米在整個生長發(fā)育過程中需水量較大，但其自身的耐旱性較差。我國每年受旱面積大約為種植面積的40%，干旱一般可使玉米減產(chǎn)20%～30%，因此，干旱成為制約我國玉米發(fā)展的首要不利因素。隨著全球氣候變暖、水資源的日益匱乏和干旱的日益加劇，耐旱玉米品種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位顯得越來越重要。干旱脅迫對玉米根系的生長發(fā)育、籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)都有較大影響，干旱脅迫抑制了玉米植株根系的生長，導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差。因此有關(guān)玉米干旱脅迫與抗旱性機理及其應(yīng)用的研究才更加迫切，培育耐旱抗旱的玉米品種才是促進干旱和半干旱地區(qū)玉米生產(chǎn)發(fā)展的有效措施，同時也是抵御干旱提高產(chǎn)量的有效途徑。

ASR（abscisic acid，stress，ripening） 蛋白是一類親水性小分子量的植物特異性蛋白。ASR基因在植物響應(yīng)發(fā)育和環(huán)境信號中發(fā)揮著重要的作用，包括衰老、果實成熟、花粉成熟和葡萄糖代謝[2-5]。并且ASR基因在ABA誘導(dǎo)和響應(yīng)生物及非生物脅迫時顯著上調(diào)[6-11]。大蕉ASR基因MpAsr受鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）誘導(dǎo)而上調(diào)表達[10]。ASR基因還可以影響果實的產(chǎn)量，玉米ASR基因（ZmASR1）的異位表達對玉米產(chǎn)量有很大的影響，這種影響并不受缺水脅迫條件的限制，ZmASR1通過調(diào)節(jié)支鏈氨基酸的生物合成基因可能有助于改善玉米的產(chǎn)量[12]。

由于ASR基因在擬南芥中不存在[9，13]，對其功能和調(diào)控機制的研究非常有限。有研究表明小麥轉(zhuǎn)錄因子基因TaASR1轉(zhuǎn)入煙草之后通過激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)和脅迫相關(guān)基因的表達來賦予其抗旱性[14]。Ricardi等在番茄中通過ChIP-SEQ技術(shù)證明番茄ASR1基因可能通過調(diào)控番茄細胞壁和水通道蛋白相關(guān)靶基因的表達來賦予番茄對干旱脅迫的耐受性[15]。前期的研究證明[12]，在玉米中ASR家族有9個成員，是目前ASR成員最多的品種，在玉米ASR基因家族9個成員中，在干旱脅迫條件下ZmASR1無論在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)組水平上都是表達量最大、變化最為明顯的，并且ZmASR1在玉米中的過量表達可以提高玉米在缺水脅迫下的籽粒產(chǎn)量，但是卻沒有對ZmASR1缺水脅迫下的調(diào)控機理進行更深入的研究，因此我們選擇ZmASR1來進行抗旱調(diào)控機理的研究更有針對性和目的性。在玉米自交系中過表達ZmASR1基因是研究ZmASR1基因在植物中如何發(fā)揮調(diào)控作用的有效途徑，對于培育玉米抗旱新品種，促進玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的理論和實踐意義。

要想在玉米自交系中過表達ZmASR1基因，首先要構(gòu)建植物表達載體，隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，我們不僅要把特定的外源基因轉(zhuǎn)入受體植物，更要將外源基因特定而高效地表達才能滿足我們的需求。啟動子序列中包含許多重要的順式作用元件，對植物基因的表達水平具有重要作用，使其成為表達調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一般認為CaMV35S啟動子在雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用廣泛，但在單子葉植物中的活性較低。而Ubiquitin啟動子來自于玉米多聚泛素蛋白基因，是一個在單子葉植物中有較強表達的組成型啟動子，在脅迫條件下，Ubiquitin基因的表達活性會顯著增強[16]。本研究從玉米自交系B73中克隆了Ubiquitin啟動子和玉米ZmASR1基因，構(gòu)建了同時含Ubiquitin啟動子和ZmASR1基因的植物表達載體，為后續(xù)獲得轉(zhuǎn)基因抗旱株系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為玉米自交系B73，菌株為大腸桿菌DH5α和植物表達載體為pCAMBIA3301，農(nóng)桿菌菌株為GV3101，酶與試劑為快速限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、HindⅢ、PmlⅠ購自Thermo Scientific公司，T4 DNA 連接酶，pMD18-T vector （simple）均購自TaKaRa公司。